רצפטורים פרופריוספציה והמתח בסרטן איברים: תרגילי מעבדה הסטודנטים
Summary
טכניקות האנטומי ופיסיולוגיות הם הפגינו כדי לטפל בתפקוד ומבנה לproprioceptors משותף וקולטניים מתח שרירים בגפיים הליכה סרטנים.
Abstract
המטרה העיקרית של הליכים אלה היא להדגים למטרות הוראה ומחקר כיצד להקליט את הפעילות של חיים עצב סנסורי עיקרי אחראי לפרופריוספציה כפי שהם מזהים מיקום ותנועה משותפים, ומתח בשרירים. פעילות חשמלית מproprioceptors הסרטנים וקולטניים מתח שתועדה על ידי מכשור נוירופיזיולוגיות בסיסי, ומתמר משמש למדידת כוח שנוצר על ידי גירוי עצב מוטורי בו זמנית. בנוסף, אנו מדגימים כיצד להכתים את הנוירונים להערכה מהירה של הסידור האנטומי שלהם או לקיבוע קבוע. מכתים מגלה ארגון האנטומי כי הוא נציג של איברי chordotonal ברוב הסרטנים. השוואה בין התגובות עצבי מתח לתגובות פרופריוצפטיביות היא כלי הוראה יעיל בקביעה כיצד נוירונים חושיים אלה מוגדרים מבחינה תפקודית וכיצד האנטומיה מתואמת לפונקציה. שלוש טכניקות צביעהמוצגים ומאפשר לחוקרים ומדריכים לבחירת שיטה שהוא אידיאלי למעבדה שלהם.
Introduction
פרופריוספציה היא התחושה של מיקום ותנועת גפיים המאפשר התנהגות מנוע מתואמת. Proprioceptors מורכב של עמדה (סטטית) ותנועת קולטנים (תנועתית). בחרקים וסרטנים, איברי chordotonal הם המבנים המספקים מידע כי למערכת העצבים המרכזית 1. לא כל איברי chordotonal span משותפים אבל הם עדיין יכולים לעקוב אחר תנועות מפרקות עקב ההתקשרות שלהם על apodemes (גיד כמו מבנים) אשר מקיף את המפרק ולעבור בשיתוף עם שרירי השלד ומפרקי ביטוי. יש רגלי סרטנים שישה פרקים, שכל אחד מן האיברים chordotonal אחד או שניים 2. בדרך כלל יש לו איבר chordotonal 60-100 או יותר נוירונים חושיים מוטבעים בתוך גדיל אלסטי, הנוירונים כי אות מצב סטטי משותף, כיוון ומהירות תנועת 3-6. הקלט מאיברי chordotonal בכל מפרק ובהרגל ולאחר מכן במרכז עיבוד המאפשר תנועות מתואמות על ידי בעלי החיים.
<p class="jove_content"> הכוחות שרירי רגליים לייצר במהלך הצירים איזומטרי ואיזוטוני מזוהים על ידי קולטנים מתח הקשורים לסיבי שריר ונספחיהם לapodemes7-9. בפרוטוקולים רגל הליכה הסרטנים הבאים אנו מציגים מתודולוגיה להקלטות מתא העצב עיקרי חושי העוקב אחר פרופריוספציה ונוירונים המגיבים לכוחות שנוצרו על ידי סיבי שריר. טכניקה להפעלת תנועות רגליים וכימותי דור כוח היא גם מוצגת, כמו גם טכניקות אנטומיים שיכול לשמש כדי לאפיין את ההסדר של מבנים במערכת עצבים ההיקפיים אלה.הנהלים יודגמו בהמשך לאפשר ניתוח מבני ותפקודי של תאי העצב המעצבבים את שני הסוגים של קולטנים ביחס למיקום שלהם על גדיל אלסטי chordotonal וapodeme. לשם המחשה, שאנו משתמשים propodite-dactylopodite (PD) איבר chordotonal, האיבר שמשתרע על פני המקטע ביותר הדיסטלי של רגל הסרטנים 3.למרות מחקרי אלקטרו מפורטים החלו את 1930s ועדיין מתבצעים היום, כמה היבטים הפכו ידועים על הקשרים המגזריות של proprioceptors במפרקים השונים ותפקידם בשליטה מתואמת של muscles10-16. הקמת הקשר בין מבנה לתפקוד בין איברי פרופריוצפטיביות, השרירים ומערכת העצבים יהיו עוד יותר לעזור להגדיר תפקידים אלה. למשל, תיוג somata והסופים הדיסטלי של נוירונים מתח מוכנסים לתוך apodeme יגלה ביחס למיקום שלהם לסיבי שריר 8,17-21.
אנו מציגים שלוש טכניקות צביעה לרגליים סרטנים שניתן להשתמש בם במחקר או מעבדות אקדמיות. מכתים מתילן כחול מספק ניגוד הולם לשרירים ועצבים, והוא מומלץ כטכניקה פשוטה לתלמידים ללמוד אנטומיה. מעבדות שיש setups מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכולות להשיג מכתים עצבי בררני יותר על ידי חשיפת העצבים לזמן קצרים לצבע 4-di-2-ASP החיוני. החלופה השלישית היא CoCl 2 מילוי, שכתמים ומתקן את תאי העצב, ואינה דורשת דימות פלואורסצנטי. למרות שזה עבודה והזמן אינטנסיבי, תהליך צביעה זה נותן ניגודיות גבוהה וספציפיות לעצבים, כי הם מלאים. יחד טכניקות אלה יכולים לשמש להשוואה בין איברי chordotonal שונים, לא רק באיבר או בין איברים, אלא גם בין מיני סרטנים וחרקים אחרים 20-22. סרטנים כחולים (sapidus ג) שימוש בהקלטות פיסיולוגיות ומכתים אנטומיים זמינים בכל רחבי הגבול הדרומי ודרום מזרחי של ארצות הברית. מין זה משמש כנציגם של הסדרי עצב chordotonal ומתח נמצאים ברוב הסרטנים. מעבדות בחוף המערבי יעדיפו להשתמש הסרטנים הרבה יותר גדולים Dungeness (מגיסטר הסרטן) לניסויים אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה של קבוצה זו של ניסויים היא 1) ללמד ולהציג את עקרונות היסוד של הקלטות תאי מאיבר פרופריוצפטיביות זיהוי ועצבי מתח ו2) כדי להדגיש את החשיבות של מיפוי האנטומי ביחס לתפקוד פיסיולוגי של מערכות חושיות מסוימות. גישה זו ניסיונית והמודלים של בעלי החיים מנוצל הם זולים וקלים יחסית לביצוע במעבדות הוראת נוירופיזיולוגיה.
הנוירונים של איברי chordotonal הם משני סוגים תפקודיים ספציפיים, אלה המגיבים לתנועה ואלו מגיבים לעמדות סטטיות. הקלטות תא בודדות ממגוון רחב של איברי chordotonal, לא משנה באיזו משותף נבדק, הראו את זה כדי להיות המקרה 3,5. ואכן, איברי chordotonal קשורים מפרקי המחושים של לובסטרים לחשוף אותם שני סוגים חושיים ואנטומיה בסיסית 27. בנוסף לקיומן של שני סוגי תא עצב (תנועה וpositiב), הנוירונים חולקים את אותה סידור האנטומי בגדילי אלסטי המיוחסים להם. Somata הגדול הממוקם proximally על הגדיל נוטה להשתייך לנוירונים הרגישים התנועה הדינמית. יש נוירונים שלאותת עמדות סטטיות somata הקטן וממוקמים distally. תאים אלה הם tonically פעילים. משותף פ"ד מכיל רק איבר chordotonal אחת בעוד יש שני איברים chordotonal בcarpus-propodus (CP) וmerus-carpus מפרקים (MC).
הנתיחה כדי לחשוף מבני פרופריוצפטיביות בסרטנים כחולים (sapidus ג) להקלטת אלקטרו דורשת אסטרטגיה שמאפשרת משותפות תנועות להתקיים בעמדות טבעיות בעת הקלטה מתא עצב תחושתי. העצבים המתח לשריר הפותחן ברגל ההליכה הוא עצב דק מאוד מורכב מכמה תאי עצב. אלא אם טיפול נלקח, עצב המתח, כמו גם את העצב המוטורי innervating השרירים להיות מגורה, יכול להיות שניזוקו במהלך נתיחה זו. עבורהקלטות אופטימליות אלקטרודות היניקה צריכה להיות מותאמות לגודל של העצב. הקלטות הן נגישות בקלות במעבדה תלמיד באמצעות מיקרוסקופ לנתח הגדלת 30-40X וmicromanipulators הסוף נמוך.
ניסויים עתידיים שיהיו מעניין להמשיך עם איברי chordotonal המשותפים יהיו לבחון פרופילים המבניים ופיסיולוגיים במהלך התחדשות רגל במינים שונים בשלבים שונים במחזור החיים כהמשך למחקר ראשוני זה המשמש מגיסטר הסרטן 19.26 . שאלות שנותרו לטפל הן 1) אין החלוקה והארגון מחדש של תאי עצב תלוי בגילו של בעל החיים בעת התחדשות איבר, 2) הן תחזיות axonal למערכת העצבים המרכזית (חוט עצב הגחון) באיבר התחדשות תפקודי או עושה את זה לקחת את הזמן ומשותף שימוש לבסס קשרים פונקציונליים, ו3) מה קורה לאקסונים ניתקו הפרוקסימלי למטוס autotomy כאשר האיבר הוא autotomized? 28
סרטנים להתאים לתנאי סביבה וטמפרטורת הסביבה שלהם, אבל לא ברור כיצד הם שומרים על תיאום בתוך מעגל עצבי כמו נוירונים לשנות את הפעילות שלהם בתגובה לשינויי טמפרטורה. קצב איטי של שינוי עשוי לאפשר לבעלי החיים קצת זמן להתאקלמות ואילו שינוי מהיר עשוי not29, 30. שינויים פיסיולוגיים בpH או osmolarity בשל חילוף חומרים, ביום 31 בהתנהגות, או השפעה על הסביבה עשויים להציב אתגרים דומים למעגלים עצביים המעורבים בפרופריוספציה. הכנות סרטנים אלה הן אידיאליים לטיפול בבעיות מסוג זה משום שתפקידם מאופיין גם ברמת תא בודדת.
בפרוטוקול זה יש לנו הראה את החשיבות הפיזיולוגית של נוירונים מתח בניטור הכוח שנוצר על ידי שריר הפותחן. ניתן לעקוב אחרי הקולטנים מתח אלה למיקום שלהם בתוך apodeme באמצעות נהלים מכתים. אלהנוירונים, כמו ביונקים, לזהות כוח ברמות שונות ולגייס נוירונים נוספים כמו עליות הכוח. התדירות בפעילות קשורה לתדירות הגירוי של הנוירון המוטורי עד שהגיעה לרוויה בקבלה פן. באמצעות פרוטוקול שחרור מהיר עם מפרק dactylus מכווץ, פעילות המתח נעלמה במהירות, אך לאחר מכן חוזרת על החזרת מתח במפרק מורחב במלואו. זהו הליך ניסיוני קלאסי כדי להמחיש את הכוח שנמדד על ידי קולטנים מתח. ניתן ליישם neuromodulators השונים להכנה כדי לראות איך זה משפיע על פיתוח כוח והתגובה עצבית. אחד ההיבטים החשובים הוא איך התגובות עצביות מעובדות ומשולבת במערכת העצבים המרכזית ואת השפעתן על פעילותם של תאי עצב מוטוריים. הטכניקות שהראינו תאפשר אחד כדי להתחיל לטפל במידע נוסף על מתח פונקצית מעגל נוירון (חושית) עצבים מוטוריים, כלומר אות ברגל בשלמותה לגנגליון ובחזרהלשריר.
הנהלים מכתים הפגינו הם מפתח להבנת הפיסיולוגיה של תאי עצב תחושתיים המעצבבת את איברי פרופריוצפטיביות. סידור האנטומי של הנוירונים המבוססים על תפקוד והגודל של סומה דומה באיברי chordotonal השונים ברגלי הסרטנים. לא ידוע אם הסדרים עצביים דומים מצויים גם במינים סרטנים אחרים או חרקים. שילוב של הקלטות פיסיולוגיות של תאים בודדים ומיפוי המיקום מאפשר יחסי פונקצית מבנה ישיר. השימור ארוך הטווח של ההסדר עם אנטומיים CoCl 2 מכתים וקיבעון מאפשר אחת לעשות שוב ושוב צעדים ולהעריך את הסידור המבני.
פרופריוספציה וקבלת מתח של שרירי שלד הן מערכות חוש המאפשרים התנהגויות מתואמות ובתגובות לסביבה חיצונית ופנימית לבעלי החיים באו לידי ביטוי במגוון רחב של הגדרות שרירי שלדs. איבר קולט שרירים בבטן של הסרטנים הוא הכנה אחרת מתועדת היטב (ראה פרויקט crawdad; http://www.crawdad.cornell.edu/) למטרות הוראה של פרופריוספציה רק עם שני נוירונים לחמים-קטע בטן 23 . היכולת להקליט מתא עצב אחד לצרורות עצבים חושיות מספקת פרטים נוספים המסייעות בהבנת העקרונות הבסיסיים של קליטה חושית. הכנות סרטנים פשוטות יחסית אלה מאפשרים אחד כדי לטפל בהיבטים בסיסיים של פרופריוספציה וניטור מתח, עם הפוטנציאל כדי לקבוע את המעגלים העצביים המאפשרים שילוב של תשומות פרופריוצפטיביות ואחרות חושיות 9-12, 32, 33 מרכזי.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לתרומה האמנותית של Hyewon קופר.
Materials
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
Referências
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. . First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. . The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -. S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
