En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel
Summary
Se presenta el protocolo para la formación de imágenes longitudinal dinámico y lesión selectiva por láser de las terminaciones nerviosas en ratones transgénicos reportero.
Abstract
Las terminaciones nerviosas en la piel están implicadas en procesos fisiológicos tales como la detección de 1, así como en procesos patológicos tales como dolor neuropático 2. Su posicionamiento de cerca a la superficie facilita imágenes microscópicas de las terminaciones nerviosas de la piel en la que viven los animales intactos. Usando microscopía multifotónica, es posible obtener imágenes finas superar el problema de la fuerte dispersión de la luz del tejido de la piel. Reportero ratones transgénicos que expresan EYFP bajo el control del promotor Thy-1 en las neuronas (incluyendo neuronas sensoriales periferia) son muy adecuados para los estudios longitudinales de las terminaciones nerviosas individuales durante períodos prolongados de tiempo hasta varios meses o incluso largo de la vida. Además, usando el mismo láser de femtosegundo como para la formación de imágenes, es posible producir lesiones altamente selectivos de fibras nerviosas para los estudios de la reestructuración de la fibra nerviosa. A continuación, presentamos un protocolo sencillo y fiable para multifotón longitudinal de imágenes in vivo ymicrocirugía láser basado en las terminaciones nerviosas de la piel de ratones.
Introduction
Terminaciones nerviosas cutáneas experimentan cambios dinámicos en diferentes estados fisiopatológicos. Las fibras nerviosas pueden pasar por el proceso de degeneración y regeneración o reestructuración en el curso de estas enfermedades como la neuropatía periférica 2 o Morton neuroma 3. Después de una lesión traumática, una parte importante de la dinámica de terminaciones nerviosas en la piel es la reinervación de la zona dañada. Sin embargo, el enfoque común para la investigación de las terminaciones nerviosas es ex vivo seccionamiento histológico que carece de información en tiempo real sobre los procesos en curso 4. El uso de marcadores fluorescentes codificadas genéticamente, es posible realizar un seguimiento de las terminaciones nerviosas en la piel de animales vivos, obteniendo así información rica y significativamente más pertinente sobre los cambios estructurales. La investigación de las terminaciones nerviosas cutáneas es posible utilizando microscopía de fluorescencia convencional, sin embargo, la luz fuerte dispersión de la tejido de la piel socava fuertemente en la calidadde los datos adquiridos 5. Microscopía multifotónica permite la adquisición de imágenes de alta resolución en los tejidos debido a la fuerte dispersión de la suma no lineal de la energía de los fotones de luz de excitación resultantes en la emisión de fluorescencia sólo desde el punto focal del objetivo. Este efecto conduce a un fuerte incremento en la profundidad de penetración y la mejora de la relación señal-ruido para la medición en los tejidos de la piel 6. Utilizando el mismo láser como para formación de imágenes, es posible producir la disección selectiva de las fibras nerviosas 7. En el siguiente protocolo se muestra el método de formación de imágenes longitudinal de las terminaciones nerviosas cutáneas in vivo en ratones transgénicos reportero combinado con lesión selectiva por láser utilizando el sistema de microscopio multifotónica disponible comercialmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo de vídeo se demuestra el método para longitudinal dos fotones de imágenes no invasiva de las terminaciones nerviosas individuales.
La dinámica de la inervación de la piel se ve afectada en enfermedades tales como la psoriasis y la neuropatía periférica 2, y en lesiones traumáticas 9. Dos fotones de imágenes permite el análisis detallado de las estructuras de fibras nerviosas en la matriz de colágeno. El uso de ratones transgénicos reportero…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Neurotar Ltd. para la asistencia técnica, la Fundación de la CIMO y FGSN de apoyo financiero.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
Referências
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