Listeria monocytogenes er en Gram-positiv bakteriell patogen ofte brukt som en stor modell, for studier av intracellulære parasitt. Imaging sent L. monocytogenes infeksjon stadier innenfor rammen av små-interfererende RNA skjermer muliggjør global studie av mobilnettet veier som kreves for bakteriell infeksjon av målet vertsceller.
Bakteriell intracellulære patogener kan bli oppfattet som molekylære verktøy for å dissekere cellulære signal kaskader på grunn av deres evne til å utsøkt manipulere og styrte celle funksjoner som er nødvendige for infeksjon av verts målet vev. Blant disse bakterielle patogener, Listeria monocytogenes er en Gram-positiv mikroorganisme som har vært brukt som et paradigme for intracellulær parasitt i karakterisering av cellulære immunresponser, og som har spilt instrument roller i oppdagelsen av molekylære veier kontrollerende cytoskeletal og membransmugler dynamikk. I denne artikkelen beskriver vi en robust mikroskopiske analyse for påvisning av sen cellular infeksjon stadier av L. monocytogenes basert på det fluorescerende merking av inlc, en utskilt bakterielt protein som akkumuleres i cytoplasma i infiserte celler, og dette assay kan bli koblet til automatiserte high-throughput små interfererende RNA-skjermer for å forkulleacterize cellulære signalveier involvert i opp-eller nedregulering av infeksjon.
Den Gram positive bakterien Listeria monocytogenes er en matbåren patogen som invaderer vertsceller, forstyrrer dens intern vacuole og replikerer i cytoplasma av vertsceller en. L. monocytogenes enkel manipulasjon i laboratoriet sammenheng (rask vekst, lav toksisitet for friske individer) forbundet med utholdenhet av bakterielle virulens trekk observert i cellulære og dyremodeller (hemolytisk aktivitet, leukocytose) tillot sin opprinnelige bruk i 1960 som en viktig modell for studiet av intracellulære snylting og for etableringen av det teoretiske grunnlaget for cellulær immunitet mot infeksjon to. I slutten av 1980 og begynnelsen av 1990-tallet, disseksjon av bakterie intracellulær syklus 3 samt molekylær karakterisering av de viktigste bakteriell virulens faktorer 4-7 favoriserte bruk av L. monocytogenes som en nøkkel molekylære verktøy for manipulasjon og study av vertcellefunksjonene. Tilstedeværelsen av avirulent (L. innocua) og virulente (L. monocytogenes) arter i Listeria slekten banet vei for komparative genomiske studiene åtte som sammen med den nylige etableringen av komplett V. monocytogenes transcriptome 9, har økt vår forståelse av utviklingen av L. monocytogenes som et menneskelig patogen og som et modellsystem for infeksjonsstudier 10.
L. monocytogenes induserer sin internalisering i vertsceller på samspillet mellom bakterielle overflateproteiner INLA og InlB med sine vertscellereseptorer E-cadherin og møtte henholdsvis 11-12. Innledende kandidatbaserte undersøkelser førte til identifikasjon av α / β catenins-aktin kobling som en vesentlig komponent i INLA-invasjon veien 13 og for phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) som en kritisk effektor av InlB- avhengig invasjon cascade 14-15. Proteomic og funksjonell-baserte analyser senere tillot identifisering av nye cytoskeletal elementene 16 og lipid andre budbringere 17 som kreves for vertscellen invasjon. Transkripsjons studier 18 og massespektrometri-baserte kvantitative proteomikk 19 har nylig kaste nytt lys om aktivering av verts signaliserer kaskader og undertrykkelse av immunresponser under L. monocytogenes infeksjon. Systembiologi tilnærminger basert på inaktivering av store sett av gener (kinomes, komplette genomer) av små interfererende RNA (siRNA) stanse har nylig åpnet nye veier for analyse av globale vert signale kaskader i sammenheng med spesifikke cellulære funksjoner, inkludert fagocytose og patogen intern 20. Genome-wide siRNA-skjermer har tidligere blitt utført for å undersøke cellulære kaskader som kreves for infeksjon i L. monocytogenes i fagocyttisk Drosophila </em> S2 celler 21-22, men denne typen analyser er ikke utført i ikke-fagocytiske celler, som representerer viktige mål for infeksjon in vivo.
Vi har optimalisert en protokoll for den mikroskopiske påvisning av sene stadier av infeksjon med L. monocytogenes som er egnet for high-throughput siRNA studier av bakteriell oppføring i epitelceller. Vår analyse tar nytte av en meget inngripende L. monocytogenes belastningen som presenterer et punkt mutasjon i PrfA, de store transcriptional regulator av L. monocytogenes virulens faktorer 6: denne mutasjonen (oppkalt PrfA *) gjengir PrfA konstitutivt aktiv 23 og fører til økt uttrykk av invasjonen proteiner INLA og InlB, derfor favorisere bakterie oppføring i ellers dårlig infiserte ikke-fagocyttiske celler. Vår avlesning for infeksjon er basert på påvisning av den cytosoliske oppsamling av det utskilte bakterieprotein inlc: dette molekylet eren pleiotropisk effector som uttrykkes fortrinnsvis ved intra-cytoplasmatisk L. monocytogenes 9 og som deltar ikke bare i bakteriell celle-til-celle spre 24, men som også modulerer vert immunresponser 25. Den fluorescerende merking av inlc sekresjon av intracellulære bakterier ikke bare gjør det mulig å klart skille infiserte fra ikke-infiserte celler, men representerer også et ende-punkt avlesning som kan benyttes til senere å dissekere infeksjon i sine forskjellige trinn: registrering, vacuolar flukt, cytosoliske bakteriell spredning og celle-til-celle-spredning. Denne mikros-basert protokoll kan bli koblet til siRNA skjermer således å studere cellulære baner som er involvert i infeksjonen av vertsceller av L. monocytogenes.
Flere parametere er kritiske for hvor vellykket inlc-deteksjon protokollen, herunder bruk av friske cellelinjer som viser en tilstrekkelig stor cytoplasma til å tillate en utvetydig påvisning av inlc signal. I analysen presenteres i denne artikkelen man foreslår derfor bruken av HeLa-celler CCL2, noe som er spesielt godt egnet for vår analyse på grunn av forlengelsen av de cytosoliske plass, andre HeLa-kloner som HeLa-celler Kyoto vise et mindre cytoplasma men kan benyttes med vår infeksjon protokollen (HeLa Kyoto…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i P. COSSART laboratorium støttes av Pasteur Institute, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233 348), den Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), Louis-JEANTET Foundation og Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK er en mottaker av et stipend fra Pasteur-Paris University International Doctoral Program / Institut Carnot sykdommer Infectieuses. Vi takker Jason Mercer for optimalisering av mobilnettet transfeksjon protokollen.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |