Vårt labb har identifierat ett protein-lipid-komplex från bröstmjölk vid namn HAMLET (för humant alfa-laktalbumin Made dödlig för tumörceller) som framkallar apoptos i tumörceller, men också möjlighet att döda en mängd olika bakteriearter ^1,2. De arter som befanns vara särskilt känsliga var de som riktar luftvägarna, med Streptococcus pneumoniae (den pneumokocker) visar den största känslighet och en apoptos-liknande fenotyp döds ^2,3. Membrandepolarisering och specifik jon transport händelser är väl beskrivna och viktiga händelser under apoptos i eukaryota celler, speciellt i mitokondrierna, där radioaktiva TPP ^+-joner och fluorescerande färger inklusive JC-1 och TMRE har använts för att demonstrera depolarisation av mitokondriemembranet ^{3 -5.} Därför sökte vi att lära oss mer om effekten av HAMLET på dessa membranrelaterade funktioner i pneumokocker som vi fokuserat våra ansträngningar attutveckla en bättre förståelse av de mekanistiska komponenterna i apoptos-liknande fenotyp i bakterier, med stora möjligheter att identifiera nya antibakteriella behandlingar eller vaccinkandidater i processen.

I sin strävan att upprätta protokoll för våra mekanistiska studier, upptäckte vi att i motsats till den väl beskrivna metoden i eukaryota system, det finns mycket få publicerade studier som beskriver elektrofysiologi och jon transportmekanismer av bakteriemembranet ^6,7. Detta är i första hand tillskrivas den mindre storleken av mikroorganismer och deras yta arkitektur, särskilt närvaron av cellväggen, begränsar att tillgängligheten av membranet för användning av konventionella eukaryota metoder som lapp fastspänning, även om vissa studier med användning av jätteprotoplaster har utförts med blandad framgång ^8,9. Eftersom arbetet med dessa gigantiska protoplaster är inte ett ideal eller ens praktisk metod för de flesta bakteriearter eftersom det kräver mannenipulated bakterier i en onaturlig och abiotisk tillstånd, har de begränsade studier av bakteriemembranet polaritet som har utförts i huvudsak användes flödescytometri och användning av cyanin-och oxonol fluorescerande färgämnen ^10-16.

Istället för flödescytometri, som samlar enskilda fluorescens avläsningar från en bakterie till en enda tidpunkt, valde vi att använda en flourenscensprövning plattläsare för att upptäcka fluorescens intensitet bakteriesuspensioner i en 96-brunnar format över tiden. Detta gjorde det möjligt att behandla en population av bakterier vid olika tidpunkter med mycket större enkelhet och lätthet, och kontinuerligt övervaka fluorescens kinetik hela befolkningen för en längre tid, vilket är svårt att uppnå med hjälp av flödescytometri. Efter att ha testat många olika potentiella känslig fluorescerande färger (inklusive de som nämnts ovan för användning med mitokondrier), nådde vi den bästa tekniska och praktiska framgång med hjälp avbis-oxonol färgämne som heter DiBAC ₄ (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) att övervaka förändringar i polaritet.

Vi fann också att det är värdefullt att samtidigt övervaka störningar i integriteten av membranet med hjälp av propidiumjodid (PI). Detta färgämne fluorescerar vid bindning till nukleinsyra, utan bara kan göra det när integriteten i bakteriemembran äventyras, vilket gör den populär komponent som används för att upptäcka döda celler i levande-död färgnings analyser. Förutom PI, Sytox grönt och TO-PRO-1 är fluorescerande färgämnen som har liknande verkan och har tidigare använts för bakterier i några studier med användning av flödescytometri detektionsmetoder ^17. Vi valde att använda PI grund av dess excitationsvåglängden som tillät oss att övervaka fluorescens samtidigt med DiBAC i ett givet prov.

I våra studier har vi observerat att HAMLET, samt annan relaterad protein-lipid-komplex med bakteriedödande aktivitetkänd som Eloa, inducerad depolarisation och bristningar i bakteriemembranet såsom indikeras av en ökning av fluorescensen för båda färgämnena vid behandling av pneumokocker ^3,18,26. För båda komplex, konstaterade vi att fluorescensintensiteten hos DiBAC ₄ (3) ökad före den ökade intensiteten i PI, vilket indikerar att depolarisation inträffat före brista och är därför en specifik händelse som induceras av våra bakteriedödande protein-lipid komplex av intresse. Denna distinktion är viktig att göra, eftersom bristning av membranet kan i sig orsaka ospecifik depolarisation. Att mäta och analysera både DiBAC ₄ (3) och PI fluorescens kinetik samtidigt tillät oss att undersöka detta förhållande mellan de två membranhändelser, vilket är en ytterligare fördel med att använda fluorometri istället för flödescytometri.

Om du vill övervaka bakterie ion flux har det funnits några tidigare framgångar med hjälp av radioisotoper, inklusive mät upptag av45 Ca ^{2 +} i pneumokocker ^19,20, vilket vi också har använt i våra nya studier ^{18, 21.} Men att arbeta med dessa radioaktiva joner har flera nackdelar. De kan vara dyra, tidskrävande och kladdigt, och kan också utsätta individen utför experimentet för att skada, beroende på den isotop av intresse. Dessutom är det svårt att följa snabba förändringar över tiden. Därför vände vi mot en alternativ mätmetod som sysselsätter acetoximetyl (AM) ester versioner av jon känslig fluorescerande indikator färgämnen. I sig själv är indikatorfärgämnet laddat och inte passerar genom membranet lätt, men med tillägg av den lipofila estergrupp, kan det nu oladdad molekyl passerar genom membranet av bakterien. När ni kommer till inredningen, bakterie esteraser klyva estergruppen, lämnar färgämnet fritt inuti cellen och ut igen, betydligt saktar dess förmåga att gå ur cellen och låta färgen to samlas inuti med tiden. Däremot har användningen av dessa ester färgämnen endast beskrivits i ett fåtal bakteriearter för att upptäcka förändringar i intracellulär ^{Ca2 + 22-24} och H ^{+ 16,} med varierande metoder för lastning, upptäckt, och framgång.

Med en önskan att övervaka förändringar i intracellulär ^{Ca2 +} och även K ⁺ och H ^+-nivåer i S. pneumoniae vid behandling med HAMLET och andra föreningar, vi skapat protokoll för att effektivt ladda fluorescerande indikatorfärgämnen i bakterieceller. Effektiv lastning in i bakterier som krävs både probenecid som ökar färgämne behålla genom att blockera anjon-transportörer och kraftdrivladdning, en patentskyddad förening från Life Technologies som ökar lasteffektiviteten. FURA-2/AM (detektering av ^{Ca2 +),} PBFI / AM (detektion av K ^+), och BCECF / AM (upptäcka H ⁺⁾ framgångsrikt laddas i både icke-inkapslat och inkapslade pneumokocker stregn som möjliggör mätning av de resulterande fluorescensmönster efter tillsats av jonoforer, såsom jonomycin (Ca ^{2 +} frikopplare), valinomycin (K ⁺ frikopplare) och CCCP (H ⁺ frikopplare) med användning av en fluorescensdetektion plattläsare ^{18, 21.}