O nosso laboratório identificou um complexo proteína-lípido a partir de leite humano chamado ALDEOLA (por alfa-lactalbumina humana Feito letal para as células de tumor), que induz a apoptose em células tumorais, mas também é capaz de matar uma variedade de espécies bacterianas ^1,2. As espécies que se verificou serem particularmente sensíveis eram os que visam o aparelho respiratório, com o Streptococcus pneumoniae (pneumococos), exibindo a maior sensibilidade e um fenótipo semelhante a apoptose de morte ^2,3. Eventos de transporte de despolarização da membrana e de iões específica são bem descritas e eventos cruciais durante a apoptose em células eucarióticas, em particular nas mitocôndrias, onde iões radioactivos ⁺ TPP e corantes fluorescentes incluindo JC-1 e TMRE têm sido utilizados para demonstrar a despolarização da membrana mitocondrial ^{3 -5.} Assim, buscou-se saber mais sobre o efeito de HAMLET sobre esses recursos relacionados à membrana no pneumococo como nós nos concentramos nossos esforços parapromover uma melhor compreensão dos componentes mecanicistas do fenótipo de apoptose como em bactérias, com grande potencial para a identificação de novas terapias anti-bacterianos ou vacinas candidatas no processo.

Ao procurar estabelecer protocolos para os nossos estudos mecanicistas, descobrimos que, em contraste com a metodologia bem descrito em sistemas eucariotas, existem muito poucos estudos que detalham electrofisiologia e transporte de iões de mecanismos de ^6,7 a membrana bacteriana. Isto é atribuído principalmente ao menor tamanho de microorganismos e sua arquitetura de superfície, em particular a presença de paredes celulares, que limita a acessibilidade da membrana para a utilização de métodos convencionais, como eucarióticos patch clamping, embora alguns estudos com protoplastos gigantes foram realizados com sucesso misturado ^8,9. Como trabalho com esses protoplastos gigantes não é um método ideal ou mesmo prático para a maioria das espécies de bactérias, uma vez que requer que o homemipulated bactérias num estado anormal e abiótico, os estudos limitados de polarização da membrana bacteriana que tenham sido efectuados empregaram principalmente de citometria de fluxo e a utilização de cianina e corantes fluorescentes oxonol ^10-16.

Em vez de citometria de fluxo, que reúne as leituras de fluorescência individuais de uma bactéria a um único ponto de tempo, optou-se por utilizar um leitor de placas de detecção de fluorescência para detectar a intensidade de fluorescência de suspensões bacterianas, em um formato de placa de 96 poços ao longo do tempo. Isto permitiu-nos para tratar uma população de bactérias em vários momentos com muito mais simplicidade e facilidade, e monitorar continuamente a cinética de fluorescência de toda a população por longos períodos de tempo, o que é difícil de conseguir por citometria de fluxo. Depois de testar uma grande variedade de corantes fluorescentes sensíveis potenciais (incluindo aqueles acima mencionados para utilização com as mitocôndrias), que obteve o melhor sucesso técnico e prático utilizando ocorante bis-oxonol chamado DiBAC ₄ (3) (bis-(ácido 1,3-dibutylbarbituric) oxonol trimethine) para monitorar mudanças na polaridade.

Encontramos também é valioso para monitorar simultaneamente interrupções na integridade da membrana utilizando iodeto de propídio (PI). Este corante fluorescente por ligação a ácido nucleico, mas é apenas capaz de fazer isso, quando a integridade da membrana bacteriana é comprometida, o que torna o componente popular usado para detectar células mortas em ensaios de coloração vivos mortos. Além PI, SYTOX verde e TO-PRO-1 são corantes fluorescentes que são semelhantes em acção e que tenham sido previamente utilizados para as bactérias em alguns estudos de citometria de fluxo, utilizando métodos de detecção ^17. Optamos por usar PI devido a seu comprimento de onda de excitação que nos permitiu acompanhar a sua fluorescência em simultâneo com DiBAC em uma dada amostra.

Em nossos estudos, observamos que HAMLET, bem como um outro complexo protéico-lipídica relacionada com a atividade bactericidaconhecido como ELOA, a despolarização induzida e ruptura da membrana bacteriana, tal como indicado por um aumento na fluorescência de ambos os corantes sobre o tratamento dos pneumococos ^3,18,26. Para ambos os complexos, observou-se que a intensidade de fluorescência de DiBAC ₄ (3) um aumento em relação ao aumento da intensidade de PI, indicando que a despolarização ocorreu antes da ruptura e é, por conseguinte, um evento específico induzida pelos nossos complexos proteína-lípido de bactericidas interesse. Esta distinção é importante para fazer, como ruptura da membrana pode-se causar despolarização inespecífica. Cinética de medição e análise, tanto DiBAC ₄ (3) e PI fluorescência simultaneamente nos permitiu analisar essa relação entre os dois eventos de membrana, o que é uma vantagem adicional do uso fluorometria em vez de citometria de fluxo.

Para monitorar o fluxo de íons bacteriana, tem havido algum sucesso anterior com o uso de radioisótopos, incluindo medição de absorção de45 Ca ^{2 +} no pneumococo ^19,20, que também têm utilizado em nossos estudos recentes ^{18, 21.} No entanto, trabalhar com esses íons radioativos tem vários inconvenientes. Eles podem ser caro, demorado e complicado, e pode também expor o indivíduo realizando a experiência de prejudicar, dependendo do isótopo de interesse. Além disso, é difícil controlar as rápidas mudanças ao longo do tempo. Assim, voltou-se para um método alternativo de medição que utiliza versões acetoximetílico (AM) de éster de corantes indicador fluorescente sensível ao íon. Por si só, o corante indicador é carregada e não passar facilmente através da membrana, mas com a adição do grupo de éster lipofílico, a molécula não carregada pode agora passar através da membrana da bactéria. Ao entrar no interior, as esterases bacterianas clivar o grupo éster, deixando o corante livre no interior da célula e novamente carregado, diminuindo significativamente a sua capacidade para sair da célula e permitindo que o corante to acumular dentro ao longo do tempo. No entanto, o uso desses corantes éster só foi descrito em algumas espécies bacterianas para detectar alterações no ^{Ca2 +} intracelular e ^22-24 H ^{+ 16,} com diferentes métodos de carregamento, detecção, e sucesso.

Com o desejo de monitorar mudanças na Ca ^{2 +} intracelular e também os níveis de K ⁺ e H ⁺ em S. pneumoniae após tratamento com ALDEOLA e outros compostos, que criado com sucesso protocolos para carregar eficientemente corantes indicadores fluorescentes em células bacterianas. Carregamento eficaz em bactérias necessárias tanto probenecida que aumenta a retenção de corante, bloqueando ânion-transportadores e carga de potência, um composto proprietário da Life Technologies, que aumenta a eficiência de carregamento. Fura-2/AM (detecção de Ca ^{2 +),} PBFI / AM (detecção de K ^+), e BCECF / AM (detecção de H ⁺⁾ foram carregados com êxito em ambos não encapsulada e encapsulado pneumocócica ruachuvas que permitem a medição dos padrões de fluorescência resultante após adição de ionóforo, tais como ionomicina (Ca ^{2 +} desacoplador), valinomicina (K ⁺ desacoplador) e CCCP (H ⁺ desacoplador) utilizando um leitor de placas de detecção de fluorescência ^{18, 21.}