Summary

Een procedure voor het implanteren van georganiseerde Arrays van microwires voor Single-unit Opnamen in Awake, Gedragen Dieren

Published: February 14, 2014
doi:

Summary

Implanteren georganiseerde arrays van microwires voor gebruik in een enkele eenheid elektrofysiologische opnames presenteert een aantal technische uitdagingen. Methoden voor het uitvoeren van deze techniek en de apparatuur die nodig zijn beschreven. Ook is het nuttig gebruik van de georganiseerde Microwire arrays op te nemen van verschillende neurale subregio's met een hoge ruimtelijke selectiviteit besproken.

Abstract

In vivo elektrofysiologische opnames in de wakkere, gedraagt ​​dier zorgen voor een krachtige methode voor het begrijpen van neurale signalering bij de single-cell niveau. De techniek maakt het mogelijk om onderzoekers tijdelijk en regionaal onderzoeken specifieke afvuren patronen om opgenomen actiepotentialen correleren met de lopende gedrag. Bovendien kan een enkele unit registraties worden gecombineerd met een overvloed aan andere technieken om uitgebreide uitleg van neurale functies te bewerkstelligen. In dit artikel beschrijven we de anesthesie en de voorbereiding voor Microwire implantatie. Vervolgens hebben we een opsomming van de benodigde apparatuur en chirurgische stappen om nauwkeurig plaats een Microwire array naar een doel structuur. Tot slot beschrijven we kort de voor de registratie van elke afzonderlijke elektrode in de array apparatuur. De vaste Microwire arrays beschreven zijn zeer geschikt voor chronische implantatie en zorgen voor longitudinale opnamen van neurale gegevens in vrijwel elke gedrags preparatiop. We bespreken tracing elektrode tracks naar Microwire posities evenals manieren om Microwire implantatie combineren met immunohistochemische technieken om de anatomische specificiteit van verkregen resultaten te verhogen driehoeksmeting.

Introduction

Elektrofysiologische registraties kunnen wetenschappers de elektrische eigenschappen van biologische cellen te onderzoeken. In het centrale zenuwstelsel, waarbij elektrische impulsen dienen als signaleringsmechanisme, deze opnamen van bijzonder belang voor het begrijpen van neurale functie 1-2. Tijdens de single-unit registraties in gedragen dieren, een micro-elektrode die in de hersenen is ingebracht is in staat om veranderingen op te nemen in de opwekking van een neuron van actiepotentialen in de tijd.

Terwijl veel technieken laten ons toe om de hersenactiviteit te registreren, single-unit elektrofysiologie is een van de meest precieze methoden doordat resolutie bij de enkel neuron niveau. Wanneer een hoge mate van ruimtelijke specificiteit gewenst is, kan microwires worden gebruikt om afzonderlijke sub-kernen of ensemble van cellen in de brain3 richten. Single-unit opnames ook profiteren van hoge tijdsresolutie wegens opnames zijn nauwkeurig op de microseconde niveau. En, in vivo eenkielzog opnames laten intact circuit interacties, met het natuurlijke milieu van afferente en efferente projecties, systemische chemische en hormonale invloeden, en fysiologische parameters. Neurale signalen worden afgeleid van zintuiglijke input, motorische gedrag, cognitieve verwerking, neurochemistry / farmacologie, of een combinatie. Dienovereenkomstig, de scheiding van sensorische, motorische, cognitieve, en chemische invloeden vereist doordachte experimenten met effectieve risico's en controles die kunnen toestaan ​​dat voor de beoordeling van elk van de bovengenoemde invloeden. Al met al, opnames in gedragen dieren mogelijk maken onderzoekers om de integratie van meerdere bronnen van informatie te observeren binnen een functionerende schakeling en een meer omvattend model van circuit functie afleiden.

Enkele eenheid opnamen ook kampen met een aantal nadelen, waarvan een experimentator moet zich bewust. Eerst en vooral, kunnen opnames moeilijk uit te voeren zijn. Inderdaad, eigenschappen van the headstage versterkers en de geïmplanteerde microwires waarmee ruimtelijke en temporele specificiteit in deze opnames maakt opnamen gevoelig voor de invloed van externe elektrische signalen (bijvoorbeeld elektrische "ruis"). Dienovereenkomstig, het vermogen om problemen op te lossen in een elektrofysiologische systeem vereist een goed ontwikkelde technische kennis van elektrofysiologische principes en apparaten. Het is ook belangrijk op te merken dat, onder bepaalde omstandigheden, opgenomen elektrische signalen in extracellulaire opnames kan de optelling van verschillende neurale signalen vertegenwoordigen. Bovendien kan gegeneraliseerd enkele eenheid activiteit populatie activiteit in een doelwit gebied vaak beperkt door de mate van cellulaire heterogeniteit binnen het doelgebied (maar zie Cardin 4). Bijvoorbeeld, zou elektroden de nadruk echter op het opnemen van hoge amplitude output vormen in plaats van andere cellen. De interpreteerbaarheid van single-unit registraties wordt verhoogddoor het combineren opnames met andere technieken, waaronder, maar niet beperkt tot, elektrische (orthodromic of antidromic), chemische (bijv. iontoforetische of ontwerper receptor) of optogenetic stimulatie 4, tijdelijke neurale inactivations, sensorimotorische onderzoeken 5, ontkoppelingsprocedure of immunohistochemie 3.

In het protocol dat volgt zullen wij de materialen en stappen die nodig sommen een georganiseerde Microwire array in ratten geïmplanteerd (hoewel het protocol kan worden aangepast voor gebruik in andere soorten). De procedure en de stijl van vaste arrays gebruikt in ons laboratorium hebben betrouwbare Longitudinale opnames bewezen en kan opnames van hetzelfde neuron houden voor meer dan een maand tijd 6-8. Dit maakt deze procedure ideaal voor de behandeling van driefase reacties op experimentele stimuli, plastische veranderingen in de neurale reacties, of mechanismen van leren en motivatie.

Protocol

De grootste zorg moeten worden genomen om aseptische omstandigheden te handhaven (zoals beschreven in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren 9) tijdens de voorbereiding voor en het uitvoeren van de volgende procedure. Het volgende protocol is in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite, Rutgers University goedgekeurd. Er wordt geschat dat de daaropvolgende procedures 3-6 uur zal nodig hebben om te vol…

Representative Results

Een lijst van de uitrusting die gebruikt wordt door dit laboratorium voor het opnemen van elektrofysiologische signalen zijn te vinden in tabel 3. Na herstel van een operatie, zijn single-eenheden geregistreerd door de stekker een unity-gain headstage in de geïmplanteerde connector. Deze headstage is via een kabel naar een commutator, dat in staat is vrije rotatie zonder onderbrekingen in de elektrofysiologische opname door het gebruik van elektrische sleepringen. De commutator kan onderwerpen vrij te …

Discussion

Extracellulaire registraties vormen een krachtige experimentele techniek die in vrijwel elke experimentele opstelling in de neurowetenschappen kunnen worden opgenomen. Draden die zijn geïmplanteerd in georganiseerde arrays kunnen worden gevolgd als hun assen passeren de hersenen en in hun doelgebied (figuur 5A). Wanneer een klein, post-experimentele laesie is gecreëerd op de niet-geïsoleerde Microwire tip om een ​​kleine ijzeren storting te maken van de roestvrij staaldraad, kan men nauwkeurig de…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door het National Institute on Drug Abuse kent DA 006886 (MOW) en DA 032270 (DJB).

Materials

Table 1. List of Surgical Materials
Gauze Fisher (MooreBrand) 19-898-144
Cotton Swabs Fisher (Puritan) S304659
Nembutal (Pentobarbital) Sigma Aldrich P3761
Atropine Methyl Nitrate Sigma Aldrich A0382
Baytril (Enrofloxacin) Butler Shein (Bayer) 1040007
Ketamine Hydrochloride Butler Shein SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine) Fisher (Perdue) 19-066452 
Stereotax Kopf Model 900
Cauterizing Tool Stoelting 59017
Dissecting Microscope Nikon SMZ445
Dental Drill Buffalo 37800
Bacteriostatic Saline Bulter Schein 8973
Jewlers Skrews Stoelting 51457
Microwire Array Microprobes Custom (Flexible)
Ground Wire Omnetics Custom Plug
Dental Acrylic Fisher (BAS) 50-854-402
Absorbable Sutures Fisher (Ethicon) NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) Fisher (Henry Schein) 008897
Table 2. List of Surgical Instruments
2x Microforceps George Tiemann & Co. #160-57 Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps George Tiemann & Co. #160-93 Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats George Tiemann & Co. #105-1125 Clamp and open incision
1x Small scissors George Tiemann & Co. #105-411 Cut sutures after tying
1x Tissue forceps George Tiemann & Co. #105-222 Holding tissue while suturing
1x Needle holder George Tiemann & Co. #105-1259 Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade) George Tiemann & Co. #105-80 (w/ #105-71 blade) Making skull incision
1x # 22 Scalpel blade George Tiemann & Co. # 160-381 Shaving scalp
1x Surgical Spatula George Tiemann & Co. #160-718 Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws Various N/A 0/80 x 1/8”
Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals
Microwire Array & Connector Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)  N/A Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc.
(Part No. Based on array characteristics)
Unity-Gain Harness/Headstage M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1200 Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (& Optional Fluid Swivel) Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) SL18C Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-Amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1198 Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter & Amplifier M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) Proj 1199 Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer EnGen (Phoenix, AZ) N/A (Custom Build) Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card  Data Translation (Marlboro, MA) DT-3010 Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card Measurement Computing (Norton, MA) PCI CTR-05 Acquires behavioral inputs and outputs

Referências

  1. Carter, M., Shieh, J. C. . Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. , (2009).
  2. Aston-Jones, G., Siggins, G. R., Kupfer, D., Bloom, F. E. . Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. , (1995).
  3. Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).
  4. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
  5. Ma, S., et al. Amphetamine’s dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. , (2013).
  6. Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
  7. Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25 (4), 1212-1227 (2007).
  8. Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324 (2), 701-713 (2008).
  9. . National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , (2011).
  10. Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30 (12), 2387-2400 (2009).
  11. Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).
  12. Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64 (9), 704-713 (2010).
  13. Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 .
  14. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
check_url/pt/51004?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Barker, D. J., Root, D. H., Coffey, K. R., Ma, S., West, M. O. A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals. J. Vis. Exp. (84), e51004, doi:10.3791/51004 (2014).

View Video