Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
dolaşımdaki eksozom tam işlevi uzun bir süre için bilinmemektedir. Şimdi bile eksozom tam yolu mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Eksozomlar taşımak beri antijenler, proteinler ve menşe ebeveyn hücrenin, hücre-hücre sinyal vericiler olarak işlev onları ilgilidir RNA (mRNA ve miRNA) esas öncelik verilmiştir.
Pek çok farklı yöntem izolasyonu ve eksozom 1,2 nicel tespiti için literatürde tarif edilmiştir. Ancak, 'altın standart' üzerinde görüş birliği ulaşıldı. Bu arada exosome araştırma alanında aktif bilim adamlarının çoğunluğu izolasyonu tutarlı bir yöntem oldukça farklı raporlar ve çalışmalar arasında karşılaştırılabilirlik daha yüksek bir derece elde etmek garanti olduğunu kabul ediyorsunuz.
Floresan aktive hücre sıralama (FACS) eksozom analizi 3 için en yaygın ve yaygın bir araçtır. FACS Ben'i varflüoresan işaretleme ile, farklı kökenlerden gelen hücreler bir aşamada karşılaştırılabilir Efit. FACS önemli dezavantajlar daha az bunların boyutunu ölçmek için, eksozomlar çapı 5 30-120 nm arasında değişir ise, bu yöntem, parçacıkların daha küçük 0,5 ila 4 um, tespit için yeterince duyarlı değildir bulunmaktadır.
Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) partikül boyutu ve eksozom morfoloji analizi için başka araçlar. Ancak, SEM ve TEM hem de numunelerin hazırlanması zaman alıcı, her iki yöntem emek-yoğun adımları dahil olduğunu dezavantajı var ve her buluntu nesil bazı riskler vardır. Her iki yöntem, yüksek numune ve bir numunenin bir parçacık binlerce karakterizasyonu için uygundur. Ayrıca, örnekler çoğu zaman bilgisi, klinik günlük rutin için bir nicel analiz çok kısa bir süre içinde eş zamanlı olarak ya da en azından analiz edilecekgerçekleştirmek zor. Yeni nesil teknikleri artık bize öncesinde yoğun hazırlık çalışmaları (örn, çevresel SEM) olmadan eksozomlar analiz sağlar. Bu modern teknikler hala ortalama sayısı ve boyut dağılımını 6 belirlemek için eksozomlar içeren büyük hacimli süspansiyonları analiz için oldukça sakıncalı.
Görselleştirme ve eksozom analizi için diğer bir yüksek ölçüde hassas bir yöntem nanopartikül izleme analizi (NTA) 'dir. Bu yöntem, fizik iki prensip yararlanır. İlk olarak, parçacıklar, bir lazer ışını ile ışımaya zaman dağınık ışık ile tespit edilir. İkinci bir fenomen olduğu için uygun bir sıvı süspansiyon içinde farklı parçacıkların difüzyon büyüklükleriyle ters orantılıdır, Brown hareketi olarak da bilinir. Bu durumda hareket, aynı zamanda, sıcaklık ve sıvının viskozitesine bağlıdır. Bununla birlikte, bu oran, doğrudan parçacık büyüklüğü ile ilgilidir ve NTA kullanılır. Yumuşak kullanmaware-tabanlı analiz, tek parçacıklardan saçılan ışığın dijital görüntüler kaydedilir. Dağınık ışık noktalar Arsalar ve hareket onların hızı, toplam partikül sayısı ve büyüklüğü dağılımının belirlenmesini kolaylaştırmak verileri sağlamak. Bu teknik en az 100 nm bir ortalama çapa sahip parçacıkların analiz edilmesi için güçlü bir araçtır.
boyutu ve konsantrasyon ölçümleri ZetaView Brown ve Elektroforez Hareket Video Analizi Mikroskop ile yapılmaktadır. Bu (bundan sonra partikül izleme aracı olarak anılacaktır), sıvı örnekleri için yarı-otomatik masa üstü nanoparçacık analiz cihazıdır. Bu parçacık izleme analizörü yanı sıra veri analizi için kullanılan yazılım ile bir dizüstü bilgisayar oluşur. Heterojen biyolojik örnekler, inorganik parçacıkların en çok homojen süspansiyonlar gibi bu yöntem için de uygundur. Bir video kamera ile bir lazer kırılmalı mikroskop parçacıkların tespiti için ve Obse için kullanılanonların hareket rvation. Mikroskop ekseni yatay ve eksozomlar ihtiva eden bir süspansiyon ile doldurulabilir hücre kanalının içine odaklanmış olsa da, lazer ışını dikey yönlendirilmiştir. mikroskop (Şekil 1) üzerinden bir dijital video kamera ile 90 ° altında kaydedilir lazer ışığı yayılımı ile ışınlanmış parçacıklar. saçılan ışığın yoğunluğu, daha büyük partiküller 60 nm çapında gözlenmesini sağlar. Böyle bir ortamda, bir parçacığın parlaklık parçacık büyüklüğü tek göstergesi değildir. Herhangi bir elektrik alanı uygulandığında, parçacık hareketinin Brownian hareketi takip eder ve parçacık boyutuna hesaplamak için bir gösterge olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, cihaz, aynı zamanda, hücre kanalı boyunca bir elektrik alanı uygulamak yeteneğine sahiptir. Bu alana maruz kaldığında, potansiyel, polarizasyon ve süspansiyon eksozom iyonik yük seviyesi, kendi hareket yönünde, daha belirleyici olmaktadır. Bir elektroforetik mo Hız ve yön sonucubility histogramı.
Izole eksozomlar analiz için en uygun yöntem bulma bir sorun olsa da, başka bir tür kan, asit, idrar, süt, amniyotik sıvı veya hücre medya gibi farklı medya, gelen eksozom etkili izolasyon yatıyor. Farklı yöntemler Ultrasantrifügasyon 1 dayandığı, şimdiye kadar tarif edilmiştir (örneğin Exoquick gibi) endüstriyel ayırma reaktifleri 7, 8 veya ayrılık ultrafiltrasyon istihdam antijen için manyetik boncuk 9 adımları.
Bu protokolde Ultrasantrifügasyon yoluyla eksozom izolasyon tüm süreci göstermek ve partikül izleme aracı vasıtasıyla süspansiyon içeren ortaya çıkan exosome analiz nasıl gösterir. Insan plazması ya da hücre kültür ortamı türetilmiş eksozom analizi için özel hususlar sağlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir biyolojik sıvıda eksozom boyutu ve yoğunluğunu ölçmek için bir yeni ve yenilikçi bir yöntem olarak kan ve bu nanoparçacık takip eksozom izolasyonu için detaylı bir protokol göstermektedir. Gösterilen deneylerde, insan periferik kan eksozom kaynağı olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu gibi idrar, balgam, hücre kültürü üstte kalan sıvı, diğer kaynakları, ayrıca test materyali olarak kullanılabilir.
İnsanlarda eksozom konsantrasyonunun biyolojik değişkenlik göre farklı bireylerden deneyler, eksozom derece değişen konsantrasyon özelliği olabilir. Ancak, biyolojik test denemesinde parçacıkların konsantrasyonu sonuçları üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenle, prob seyreltme için güvenilir ve standart bir yaklaşım gereklidir. Sunulan yöntem eksozom ihtiva eden plazma periferik tam kan, 9 ml elde edilmiştir. Diferansiyel santrifüj kullanılarak bir eksozom pelet izole edilmiştir adım1 ml plazma ve süspansiyona eksozom çalışma örneği meydana getirmek üzere damıtık su 5 ml yeniden süspansiyon haline. Bu ön-tanımlı ayar parçacıkların uygun bir konsantrasyon, NTA sırasında, yani uygun dağılım yoğunluğu ile bize sağladı. Hacmi ve seyreltme açıdan yanında, kullanılan çözeltilerin bir bileşim de büyük önem taşımaktadır. Biz eksozom son yeniden süspansiyon için distile su kullandık. Tabii ki, nihai seyreltme adımı için farklı medya da deney düzeneği gereklerine göre kullanılabilir. Ancak, tamponlama kapasitesi ile test, özellikle iyonik çözeltiler zeta potansiyel ölçümleri durumunda, türbülans bağımsız koşullarda ihtiyatlı bir seyreltme yararlıdır. Birden örneklerin doğrudan karşılaştırma için biz tüm örnekler için aynı seyreltme seviyesini tutmanızı öneririz. Hassasiyet ve video çözünürlüğü hariç tüm ayarlar ZetaView Analizi yazılımı kullanılarak sonradan değiştirilebilir.
<p class="Yazarlar" burada tanıttı sistem şu anda en uygun enstrüman temsil inanıyorum rağmen "jove_content">, sadece mevcut NTA sistem değildir. Daha önceki raporlarda bir dizi aynı NTA ilkelerini uygulamak, ancak bazı farklı özelliklere 10 ile birlikte gider başka enstrüman tasarımı sağlayan diğer sistemleri istihdam var. Biz sonuçların örnek işleme ve tekrarlanabilirlik ile ilgili pratik yönleri eksozom değerlendirme için metodolojik dizisi seçiminde merkezi öneme sahip olduğuna inanıyoruz. Biz de ideal bir algılama sistemi ölçümleri sonuçları ile etkileşime girebilir kullanıcı bağlı faktörleri ortadan kaldırmak gerektiğine inanıyoruz. Burada sunulan eksozom analiz yaklaşımı yüksek derecede kolay kullanım kriterlerini yerine getirmektedir. İlave bir avantaj olarak, numune, yarı-otomatik bir analiz, kısa sürede sonuç üreten, hızlı bir şekilde gerçekleşmektedir. Eksozom bir çevrimiçi görselleştirme ga için analizörü yardımcılarıeksozom özellikleri, örneğin, brüt konsantrasyon bir anlık fikir.Burada sunulan ölçüm tekniği çok basit ama şık bir ek antikor etiketli eksozomlann kullanımı ve dedektör önünde bir önceki filtre kullanarak dağınık lazer ışınının yakalama. Bu şekilde, eksozom alt-popülasyonları bulunduğunu seçici floresan boyama teknik erişilebilir yüzey antijenleri ve diğer biyolojik olarak ilgili özelliklerine göre ayırt edilebilir.
Bizim parçacık izleme aracının güncel sürümü bir dezavantajı çok yüksek hassasiyet seviyelerinde arka plan gürültüsü gibi eserler hücre kanalı duvarına dayanan, mevcut olabilir olmasıdır. Mevcut sisteme bir teknik çözüm ve iyileştirme yakın gelecekte kullanılabilir hale gelebilir. Kanal duvarına lazer dağılım ışık bu yöntem yansımaları ile bu şekilde artan azalacaktır Ölçülen sinyaller ve elde edilen verilerin ve algılama sınırı düşürücü doğruluğu.
Exosome izolasyonu için şu anda kullanılan protokol köklü ve uygulamalı parçacık izleme aracı, 30 nm düşük boyut dağılımı ile son derece hassas çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, tespit edilen parçacıklar aslında tamamen doğru eksozomlar olduğuna dair hiçbir garanti yoktur. Bu gibi ölü hücre fragmanları ya da daha büyük bir protein kompleksleri gibi diğer parçacıklar da eksozom süspansiyon içinde mevcut olabilir ve yanlış pozitif sinyallere neden olabilir. Örneğin "kirlilik" elektron mikroskobu (EM), iletim EM ya da tarama EM da olabilir dışı bırakılabilir hangi biri güvenilir bir yöntem. Daha önce önerilen yüzey markerlerinin bir dizi tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, vb 11 de dahil olmak üzere dikkat artan bir miktarını, kazanmıştır, ancak ne yazık ki, eksozom için genel ve spesifik bir işaretleyici, şimdiye kadar tanımlanmış edilmiştir.
"> Bağımsız olarak eksozom biyoloji, özellikle de eksozom özel işaretleyiciler ile ilgili araştırma, gelecekteki ilerleme, burada sunulan protokol izolasyonu ve eksozom tespiti için güçlü bir yöntem sağlar. Konsantrasyon ve büyüklüğü de kolayca bir yazılım destekli tespit edilebilir basit moda. selektif floresan belirteçler ya da fluoroforun birleştiğinde antikorların eklenmesi muhtemel daha NTA sunulmuştur yaklaşımın olası uygulamalarını geliştirmek olacaktır.Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
Referências
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
