طريقة مبتكرة لExosome الكمي وقياس الحجم
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
وظلت وظيفة بالضبط من exosomes تعميم مجهولة لفترة طويلة من الزمن. حتى الآن ليست مفهومة تماما آلية المسار الكامل من exosomes. منذ exosomes تحمل بصورة رئيسية أعطيت المستضدات والبروتينات والحمض النووي الريبي (مرنا وميرنا) التي تتعلق بهم إلى خلية الوالدين الأصلية، وظيفتها والإرسال يشير خلية خلية ذات الأولوية.
وقد وصفت العديد من الأساليب المختلفة في الأدب لعزل والكشف الكمي للexosomes 1،2. ومع ذلك، لم يتم التوصل إلى توافق في الآراء بشأن "معيار ذهبي". وفي الوقت نفسه فإن غالبية العلماء نشط في مجال البحوث exosome يتفقون على أن طريقة متسقة من العزلة وتبرر للغاية لتحقيق درجة أعلى من المقارنة بين التقارير والدراسات المختلفة.
مضان تنشيط الفرز الخلية (FACS) هو الأداة الأكثر شيوعا وانتشارا للتحليل exosome 3. FACS لديه بنefit ذلك، عن طريق وضع العلامات مضان، الخلايا من أصول مختلفة يمكن مقارنة في خطوة واحدة. المساوئ الرئيسية للFACS هي أن هذه الطريقة ليست حساسة بما فيه الكفاية لتحديد جزيئات أصغر من 0.5 ميكرومتر 4، في حين exosomes عموما بين 30-120 نانومتر في القطر 5، وحتى أقل لقياس حجمها.
المجهر الإلكتروني (SEM) وانتقال المجهر الإلكتروني (TEM) هي أدوات أخرى لتحليل حجم الجسيمات ومورفولوجية exosomes. ومع ذلك، على حد سواء SEM وTEM يكون العيب أن إعداد عينات هو، على حد سواء أساليب تنطوي على خطوات كثيفة العمالة تستغرق وقتا طويلا ولكل منها بعض المخاطر من الجيل قطعة أثرية. لا طريقة مناسبة لعالية الإنتاجية عينة وتوصيف عدة آلاف من الجزيئات واحدة من عينة واحدة. وعلاوة على ذلك، والتحليل الكمي للروتين اليومي السريرية حيث توجد عينات كثير من الأحيان ليتم تحليلها في وقت واحد أو على الأقل في فترة قصيرة جدا هومن الصعب القيام بها. تقنيات الجيل الجديد يسمح لنا الآن لتحليل exosomes دون العمل التحضيري المكثف مسبق (SEM على سبيل المثال، البيئية). هذه التقنيات الحديثة لا تزال غير مريح بدلا لتحليل تعليق حجم كبيرة تحتوي على exosomes لتحديد متوسط عدد وحجم التوزيع 6.
طريقة أخرى حساسة للغاية لتصور وتحليل exosomes هو تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر (NTA). هذه الطريقة يستفيد من مبدأين مختلفة من الفيزياء. أولا، والكشف عن جسيمات من قبل الضوء المتناثرة عندما يتم المشع أنها مع شعاع الليزر. ومن المعروف أن الظاهرة الثانية كما الحركة البراونية، التي تنص على نشر جزيئات مختلفة في تعليق السائل يتناسب عكسيا مع حجمها. في الحالة الأخيرة يعتمد الحركة أيضا على درجة الحرارة واللزوجة من السوائل. ومع ذلك فإن هذه النسبة ترتبط مباشرة حجم الجسيمات ويستخدم من قبل NTA. باستخدام لينةالتحليل القائم وير، وتسجل الصور الرقمية من الضوء المتناثرة من الجزيئات واحدة. قطع من بقع الضوء المتناثرة وسرعتهم الحركة توفر البيانات التي تسهل تحديد إجمالي عدد الجسيمات وحجم التوزيع. هذه التقنية هي قوية بشكل خاص لتحليل جزيئات بقطر متوسط أقل من 100 نانومتر.
يتم تنفيذ قياسات حجم وتركيز مع ZetaView البراونية وتحليل الكهربائي فيديو الحركة المجهر. وهذا هو أعلى جسيمات متناهية الصغر تحليل صك الآلي شبه مكتب للعينات السائلة (المشار إليه فيما بعد كأداة تتبع الجسيمات). وهو يتألف من جسيمات تتبع محلل وكذلك جهاز كمبيوتر محمول مع البرمجيات المستخدمة لتحليل البيانات. عينات بيولوجية غير المتجانسة هي كما مناسبة لهذا الأسلوب إلى التوقيف أكثر تجانسا من الجزيئات غير العضوية. ويستخدم المجهر نثر الليزر مع كاميرا الفيديو للكشف عن الجسيمات وللobservation من حركتهم. في حين أن محور المجهر هو أفقي وركز في القناة خلية مليئة تعليق يحتوي على exosomes، يتم توجيه شعاع الليزر عموديا. الجسيمات المشع من قبل مبعثر ضوء الليزر، والتي يتم تسجيلها تحت 90 ° بواسطة كاميرا الفيديو الرقمية عبر المجهر (الشكل 1). شدة الضوء المتناثرة تتيح مراقبة الجزيئات الكبيرة 60 نانومتر القطر. في مثل هذا الوضع سطوع الجسيمات ليست المؤشر الوحيد من حجم الجسيمات. عندما يتم تطبيق أي حقل كهربائي، حركة الجسيمات يتبع فقط الحركة البراونية ويمكن أن تكون مؤشرا لحساب حجم الجسيمات. ومع ذلك، فإن الصك هو أيضا قادرة على تطبيق مجال كهربائي عبر القناة الخلية. عندما تتعرض لهذا المجال، والمحتملين، والاستقطاب ومستوى الأيونية تهمة للexosomes علقت تصبح مزيد من محددات اتجاه حركتها. السرعة والاتجاه نتيجة في مو الكهربيبيليتي الرسم البياني.
في حين إيجاد طريقة الأمثل لتحليل exosomes معزولة هو مشكلة واحدة، وآخر يكمن في عزلة فعالة من exosomes من وسائل الإعلام المختلفة، مثل الدم، استسقاء، والبول، والحليب، والسائل الذي يحيط بالجنين أو وسائل الإعلام الخلية. وقد وصفت أساليب مختلفة حتى الآن، والتي تقوم على تنبيذ فائق 1، الكواشف فصل الصناعية (مثل Exoquick) 7، حبات مغناطيسية للمستضد توظيف الفصل 8 أو 9 خطوات الترشيح الفائق.
في هذا البروتوكول ونحن لشرح العملية برمتها من exosome العزلة عبر تنبيذ فائق وإظهار كيفية تحليل exosome الناتجة تحتوي على تعليق من خلال أداة تتبع الجسيمات. وتقدم اعتبارات محددة لتحليل البلازما أو زراعة الخلايا البشرية المتوسطة exosomes مشتقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
علينا أن نظهر بروتوكول مفصلة لعزل exosome من الدم والحاضر تتبع جسيمات متناهية الصغر باعتبارها الرواية وطريقة مبتكرة لقياس حجم exosome والتركيز في السائل البيولوجي. في التجارب المعروضة تم استخدام الدم المحيطي البشري وأصل exosomes. ومع ذلك، أصول أخرى، مثل البول، البلغم، وزراعة الخلايا طاف وغيرها، ويمكن أيضا أن تستخدم كمادة اختبار.
على أساس التباين البيولوجي للتركيز exosome في البشر، قد المقايسات من مختلف الأفراد ميزة تركيز متفاوتة بشكل ملحوظ من exosomes. ومع ذلك، فإن تركيز الجزيئات في اختبار التحقيق البيولوجي قد يكون لها تأثير على النتائج. ولذلك، هناك حاجة إلى نهج موثوق وموحد لتخفيف من تحقيقات. في طريقة عرض تم إنشاؤها exosome تحتوي البلازما من 9 مل من الدم الكامل الطرفية. باستخدام الطرد المركزي التفاضلي الخطوات تم عزل بيليه exosome من 1 مل البلازما وإعادة وقف التنفيذ في 5 مل من الماء المقطر أن يؤدي في العينة عمل exosomes مع وقف التنفيذ. وقد وفرت هذا الإعداد محددة مسبقا لنا مع تركيز السليم للجزيئات، أي كثافة مبعثر المناسبة أثناء NTA. بجانب حجم والتخفيف الجانب، وتكوين الحلول التي تستخدم أيضا من أهمية. وقد استخدمنا الماء المقطر لنهائي اعادة تعليق من exosomes. وبطبيعة الحال، وسائل الإعلام المختلفة للخطوة التخفيف النهائية يمكن أن تستخدم أيضا، وفقا لمتطلبات التجريبية مجموعة المتابعة. ومع ذلك، في حالة القياسات زيتا المحتملة من الحلول الأيونية، وخاصة عند اختبار عينات بسعة التخزين المؤقت، والتخفيف من الحكمة في ظروف خالية الاضطراب مفيد. للمقارنة مباشرة من عينات متعددة نوصي الحفاظ على مستوى التخفيف نفسه لجميع العينات. يمكن تغيير جميع إعدادات باستثناء حساسية ودقة الفيديو بعد ذلك باستخدام برنامج التحليل ZetaView.
<p class="jove_content"> على الرغم من أن الكتاب يعتقدون أن النظام قدم هنا يمثل حاليا الصك الأنسب، أنها ليست متوفرة نظام NTA الوحيد. وهناك عدد من التقارير السابقة قد استخدمت النظم الأخرى التي تطبق مبادئ NTA نفسها ولكن توفير تصميم آخر الصك الذي يسير جنبا إلى جنب مع بعض الميزات المختلفة 10. ونحن نعتقد أن الجوانب العملية المتعلقة التعامل مع العينة واستنساخ نتائج ذات أهمية مركزية في اختيار تسلسل منهجي لتقييم exosome. ونحن نعتقد أيضا أن نظام الكشف المثالي يجب القضاء على عوامل اعتمادا المستخدم التي قد تتداخل مع نتائج القياسات. نهج تحليل exosome أن يرد هنا يفي معيار سهولة التعامل بدرجة عالية. باعتبارها ميزة أخرى، يتم إجراء التحليل الآلي شبه من العينات في عملية سريعة، وتوليد النتائج في وقت قصير. والتصور عبر الإنترنت من exosomes الايدز محلل لالجافي فكرة الفورية من الخصائص exosome، على سبيل المثال، وتركيز الإجمالي.إضافة بسيطة جدا ولكن أنيقة لتقنية قياس المقدمة هنا هي استخدام الأجسام المضادة المسمى exosomes والقبض على شعاع الليزر المنتشرة باستخدام فلتر السابق أمام كاشف. وبهذه الطريقة يمكن التمييز بين المجموعات السكانية الفرعية exosome وفقا لمستضدات السطحية وخصائصها الأخرى ذات الصلة من الناحية البيولوجية التي يمكن الوصول إليها من الناحية الفنية إلى تلطيخ الفلورسنت انتقائي.
عيب واحد من الإصدار الحالي من لدينا أداة تتبع الجسيمات هو حقيقة أنه في مستويات حساسية عالية جدا التحف مثل الضوضاء الخلفية قد تصبح الحالي، الذي يقوم على الجدار قناة الخلية. قد يصبح الحل التقني وتحسين للنظام الحالي متاحة في المستقبل القريب. بواسطة هذه الطريقة انعكاسات ضوء الليزر مبعثر على الحائط القناة سيتم تخفيض، وبالتالي زيادة دقة الإشارات قياس والبيانات التي تم الحصول عليها وخفض الحد من الكشف.
على الرغم من أن البروتوكول المستخدم حاليا لexosome العزلة راسخة وتطبيق أداة تتبع الجسيمات لديه قرار دقيقة بشكل ملحوظ مع توزيع حجم أقل من 30 نانومتر، ليس هناك ما يضمن أن الجسيمات الكشف هي في الواقع exosomes حقيقية تماما. الجزيئات الأخرى، مثل شظايا خلية ميتة أو مجمعات البروتين أكبر قد تكون أيضا موجودة في تعليق exosome وتؤدي إلى إشارات إيجابية كاذبة. واحد طريقة موثوق بها التي من هذا القبيل "التلوث" يمكن استبعادها قد يكون المجهر الإلكتروني (EM)، إما EM نقل أو مسح EM. للأسف، لم يتم التعرف على علامة العامة والخاصة لexosomes حتى الآن، على الرغم من أن عددا من علامات سطح المقترحة سابقا اكتسبت قدرا متزايدا من الاهتمام، بما في ذلك tetraspanin (Tspan)، CD81، C63، CD9، الخ 11.
"> وبغض النظر عن التقدم في المستقبل من البحوث حول علم الأحياء exosome، ولا سيما فيما يتعلق علامات محددة exosome، فإن البروتوكول الذي يرد هنا توفر وسيلة قوية لعزل والكشف عن exosomes. يمكن تحديد تركيز وحجم بسهولة في المساعدة البرمجيات سوف الأزياء واضحة. وإضافة علامات الفلورسنت انتقائية أو fluorophore إلى جانب الأجسام المضادة من المرجح زيادة تعزيز التطبيقات الممكنة للنهج قدمت من NTA.Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
Referências
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
