Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
L'esatta funzione di exosomes circolanti rimasto sconosciuto per un lungo periodo di tempo. Anche ora il meccanismo percorso completo di esosomi non è del tutto chiaro. Dal esosomi portano antigeni, proteine e RNA (mRNA e miRNA), che li riferisce alla loro cella genitori di origine, la loro funzione come trasmettitori di segnalazione cellula-cellula è principalmente stata data la priorità.
Molti metodi differenti sono stati descritti in letteratura per l'isolamento e la determinazione quantitativa di esosomi 1,2. Tuttavia, nessun consenso su un 'gold standard' è stato raggiunto. Nel frattempo la maggioranza degli scienziati attivi nel campo della ricerca exosome concordano che un metodo coerente di isolamento è altamente giustificato per raggiungere un grado di comparabilità tra i diversi rapporti e studi più elevato.
Fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) è lo strumento più comune e diffusa per l'analisi exosome 3. FACS ha benEFIT che, tramite l'etichettatura di fluorescenza, le cellule di diversa provenienza possono essere confrontati in un solo passo. I principali svantaggi di FACS sono che questo metodo non è abbastanza sensibile per identificare le particelle inferiori a 0,5 micron 4, considerando exosomes sono generalmente compresi tra 30-120 nm di diametro 5, ancor meno per misurare le loro dimensioni.
Microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono altri strumenti per l'analisi della dimensione delle particelle e la morfologia di esosomi. Tuttavia, sia SEM e TEM hanno lo svantaggio che la preparazione dei campioni è, entrambi i metodi coinvolgono fasi intensità di lavoro che richiede tempo e ciascuno ha un certo rischio di generazione manufatto. Né metodo è adatto per un'elevata produttività e caratterizzazione di diverse migliaia di singole particelle di un campione. Inoltre, un'analisi quantitativa per clinica routine in cui i campioni devono spesso essere analizzati simultaneamente o almeno in un periodo molto breve èdifficile da eseguire. Tecniche di nuova generazione permettono ora di analizzare esosomi senza un intenso lavoro preparatorio prima (SEM esempio, ambientale). Queste tecniche moderne sono ancora piuttosto scomodo per l'analisi di grandi volumi contenenti sospensioni esosomi per determinare il loro numero medio e distribuzione delle dimensioni 6.
Un altro metodo molto sensibile per la visualizzazione e l'analisi di esosomi è-nanoparticelle tracciamento analisi (NTA). Questo metodo sfrutta due diversi principi di fisica. In primo luogo, le particelle vengono rilevati dalla luce dispersa quando vengono irradiate con un raggio laser. Il secondo fenomeno è noto come moto browniano, secondo cui la diffusione di particelle differenti in una sospensione liquida è inversamente proporzionale alle loro dimensioni. In quest'ultimo caso il movimento dipende anche dalla temperatura e dalla viscosità del liquido. Tuttavia, questo tasso è direttamente correlata alla dimensione delle particelle ed è utilizzato da NTA. Utilizzando morbidoanalisi basata-ware, immagini digitali di luce diffusa da singole particelle sono registrati. Piazzole di punti luce sparsi e la loro velocità di movimento forniscono dati che facilitano la determinazione del conteggio particellare totale e distribuzione delle dimensioni. Questa tecnica è particolarmente potente per analizzare particelle con un diametro medio inferiore a 100 nm.
Le dimensioni e la concentrazione misurazioni vengono effettuate con il ZetaView browniano e elettroforesi Motion Video Analysis microscopio. Si tratta di un banco di top nanoparticella strumento di analisi semi-automatico per campioni liquidi (di seguito denominato strumento di monitoraggio di particelle). Consiste dell'analizzatore particle tracking e un computer portatile con il software utilizzato per l'analisi dei dati. Campioni biologici eterogenei sono adatti per questo metodo come sospensioni più omogenei di particelle inorganiche. Un microscopio laser scattering con una videocamera viene utilizzata per il rilevamento di particelle e per la observation del loro movimento. Mentre l'asse orizzontale e microscopio è concentrata nel canale cella riempita con una sospensione contenente esosomi, il raggio laser è orientato verticalmente. Le particelle irradiate dalla dispersione laser la luce, che viene registrata meno di 90 ° da una videocamera digitale attraverso il microscopio (Figura 1). L'intensità della luce diffusa consente l'osservazione di particelle più grandi di 60 nm di diametro. In una tale impostazione di luminosità di una particella non è l'unica indicazione della dimensione delle particelle. Quando viene applicato alcun campo elettrico, il movimento delle particelle segue solo moto browniano e può servire come indicatore per il calcolo delle dimensioni delle particelle. Tuttavia, lo strumento è in grado di applicare un campo elettrico attraverso il canale della cella. Quando sono sottoposti a questo campo, il potenziale, polarità e livello di ionica-carica delle exosomes sospesi diventano ulteriori determinanti della direzione del loro movimento. Velocità e direzione risultato in un mo elettroforeticobilità istogramma.
Mentre trovare un metodo ottimale per analizzare exosomes isolato è un problema, un altro sta nella effettiva isolamento di exosomes di diversi mezzi, come sangue, ascite, urina, latte, liquido amniotico o supporto cellulare. Sono stati descritti finora metodi diversi, che si basano su ultracentrifugazione 1, reagenti di separazione industriali (come Exoquick) 7, sfere magnetiche per l'antigene che impiegano la separazione 8 o ultrafiltrazione passi 9.
In questo protocollo dimostriamo l'intero processo di isolamento exosome via ultracentrifugazione e mostrare come analizzare il exosome conseguente sospensione contenente attraverso lo strumento di monitoraggio delle particelle. Sono fornite considerazioni specifiche per l'analisi delle medie plasma o coltura cellulare umana esosomi derivati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dimostriamo un protocollo dettagliato per l'isolamento exosome dal sangue e presente tracciamento nanoparticelle come un romanzo e metodo innovativo per misurare le dimensioni exosome e concentrazione in un fluido biologico. Negli esperimenti presentati sangue periferico umano è stato utilizzato come origine dei esosomi. Tuttavia, altre origini, quali urina, espettorato, supernatante di coltura cellulare, ecc, possono essere utilizzati anche come materiale di prova.
Sulla base della variabilità biologica di concentrazione exosome negli esseri umani, test di diversi individui possono caratterizzato da una notevole variabile concentrazione di esosomi. Tuttavia, la concentrazione di particelle nella sonda di test biologico può avere un impatto sui risultati. Pertanto, è necessario un approccio affidabile e standardizzato per la diluizione di sonde. Nel metodo presentato exosome contenente plasma è generato da 9 ml di sangue intero periferico. Utilizzando centrifugazione differenziale passaggi un pellet exosome stato isolato da1 ml di plasma e risospeso in 5 ml di acqua distillata per portare nel campione di lavoro di esosomi sospesi. Questa impostazione predefinita ci ha fornito una corretta concentrazione di particelle, cioè, intensità scatter appropriato durante NTA. Accanto all'aspetto volume e diluizione, la composizione delle soluzioni che vengono utilizzati è anche di importanza. Abbiamo usato l'acqua distillata per la finale risospensione di esosomi. Naturalmente, possono anche essere utilizzati diversi supporti per la fase di diluizione finale, secondo le esigenze del set-up sperimentale. Tuttavia, nel caso di misure potenziali zeta di ionici-solutions, soprattutto nelle prove campioni con una capacità tampone, una diluizione prudente condizioni liberi turbolenza è utile. Per il confronto diretto di più campioni si consiglia di mantenere lo stesso livello di diluizione per tutti i campioni. Tutte le impostazioni, tranne la sensibilità e la risoluzione video possono essere modificate in seguito utilizzando il software di analisi ZetaView.
<p class="Jove_content"> Sebbene gli autori ritengono che il sistema introdotto qui rappresenta attualmente lo strumento più idoneo, non è l'unico sistema NTA disponibili. Una serie di studi precedenti hanno impiegato altri sistemi che applicano gli stessi principi NTA ma forniscono un altro disegno strumento che va di pari passo con alcune caratteristiche diverse 10. Riteniamo che gli aspetti pratici relativi alla manipolazione del campione e la riproducibilità dei risultati sono di importanza centrale nella scelta della sequenza metodologica per la valutazione exosome. Riteniamo inoltre che un sistema di rilevamento ideale dovrebbe eliminare i fattori dall'utente a seconda che possono interferire con i risultati delle misurazioni. L'approccio di analisi exosome che viene presentato qui soddisfa il criterio di maneggevolezza per un alto grado. Come ulteriore vantaggio, l'analisi semiautomatica dei campioni viene eseguita in un processo rapido, generando risultati in breve tempo. Una visualizzazione online esosomi aiuta l'analizzatore di gain un'idea istante delle caratteristiche exosome, ad esempio, la concentrazione lordo.Un semplice ma elegante aggiunta alla tecnica di misura qui presentato è l'uso di anticorpo marcato exosomes e la cattura del fascio laser diffusa utilizzando un filtro precedente davanti al rivelatore. In questo modo sottopopolazioni exosome si distinguono in base alla loro antigeni di superficie e altre caratteristiche biologicamente rilevanti tecnicamente accessibili a una colorazione fluorescente selettiva.
Uno svantaggio della versione corrente del nostro strumento di monitoraggio delle particelle è il fatto che a livelli molto elevati di sensibilità manufatti come rumore di fondo possono diventare presente, che si basa sulla parete di canale della cella. Una soluzione tecnica e miglioramento del sistema attuale possono essere disponibili in un prossimo futuro. Con questo metodo le riflessioni della luce dispersione laser sulla parete del canale sarà ridotto, aumentando così la precisione dei segnali misurati ei dati ottenuti e l'abbassamento del limite di rilevabilità.
Sebbene il protocollo attualmente utilizzato per l'isolamento exosome è ben consolidata e lo strumento particle tracking applicato ha una risoluzione notevolmente preciso con una distribuzione di dimensione inferiore a 30 nm, non c'è garanzia che le particelle rilevate sono infatti del tutto veri exosomes. Altre particelle, come frammenti di cellule morte o grandi complessi proteici possono anche essere presenti nella sospensione exosome e portare a segnali falsi positivi. Un metodo affidabile per cui tale "inquinamento" può essere escluso può essere microscopia elettronica (EM), sia EM trasmissione o scansione EM. Purtroppo, nessun indicatore generale e specifico per esosomi è stato identificato finora, anche se un certo numero di marcatori di superficie proposti in precedenza hanno acquisito una crescente quantità di attenzione, tra cui tetraspanine (tspan), CD81, C63, CD9, ecc 11.
"> A prescindere dal futuro progresso della ricerca sulla biologia exosome, soprattutto per quanto riguarda gli indicatori specifici exosome, il protocollo che viene qui presentata fornisce un potente metodo per l'isolamento e la rilevazione di esosomi. Concentrazione e dimensioni possono essere facilmente determinato in un assistito software- modo semplice. L'aggiunta di marcatori fluorescenti selettivi o anticorpi fluoroforo accoppiato probabilmente migliorare ulteriormente le possibili applicazioni del metodo presentato di NTA.Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
Referências
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
