Agroinfiltrasjon og PVX agroinfeksjon er rutinemessige funksjonelle analyser for forbigående ektopisk uttrykk for gener i planter. Disse metodene er effektive analyser i effektoromics strategier (rask motstand og avirulens genoppdagelse) og avgjørende for moderne forskning innen molekylær plantepatologi. De oppfyller etterspørselen etter robust funksjonell analyse med høy gjennomstrømning i anlegg.
Agroinfiltrasjon og PVX-agroinfeksjon er to effektive forbigående uttrykksanalyser for funksjonell analyse av kandidatgener i planter. Det mest brukte middelet for agroinfiltrasjon er Agrobacterium tumefaciens, et patogen av mange dikotplantearter. Dette innebærer at agroinfiltrasjon kan brukes på mange plantearter. Her presenterer vi våre protokoller og forventede resultater når du bruker disse metodene på potet (Solanum tuberosum), dens relaterte vill tuberbærende Solanum-arter (Solanum-delen Petota) og modellanlegget Nicotiana benthamiana. I tillegg til funksjonell analyse av enkeltgener, for eksempel resistens (R) eller avirulens (Avr) gener, er agroinfiltrasjonsanalysen veldig egnet for å rekapitulere R-AVR-interaksjonene forbundet med spesifikke vertspatogeninteraksjoner ved ganske enkelt å levere R- og Avr-transgenes inn i samme celle. Noen plantegenotyper kan imidlertid øke ikke-spesifikke forsvarsresponser på Agrobacterium, som vi for eksempel observerte for flere potetgenotyper. Sammenlignet med agroinfiltrasjon er deteksjon av AVR-aktivitet med PVX agroinfection mer følsom, mer høy gjennomstrømning i funksjonelle skjermer og mindre følsom for ikke-spesifikke forsvarsresponser på Agrobacterium. Imidlertid kan ikke-spesifikk forsvar mot PVX oppstå, og det er fare for å gå glipp av svar på grunn av virusindusert ekstrem motstand. Til tross for slike begrensninger, er agroinfiltrasjon og PVX-agroinfeksjon etter vår erfaring både egnede og komplementære analyser som kan brukes samtidig for å bekrefte hverandres resultater.
Effectoromics, en høy-gjennomstrømning funksjonell genomikk tilnærming har nylig dukket opp som et kraftig verktøy for å identifisere resistens (R) gener i avlinger planter og matchende avirulens (Avr) gener av patogener1-4. I motsetning til den mer tidkrevende stabile transformasjonen med R-gener, er effektoromics-strategien basert på forbigående analyser av patogengensekvenser.
Siden genomikktiden har genomer av plantepatogener blitt utforsket mye. For eksempel for oomycetes, som inkluderer de mest ødeleggende plantepatogenene, har store samlinger av sekvenser blitt generert og analysert for gener som spiller en rolle under samspillet med planten5-10. En klasse av patogenproteiner representerer effektorer, som manipulerer vertscellestruktur og funksjon enten for å lette infeksjon (virulensfaktorer) eller for å utløse forsvarsresponser (avirulensfaktorer)11-13. Uttrykk for Avr-gener i planteceller som inneholder R-gener resulterer vanligvis i den overfølsomme celledødsresponsen (HR)14,15. I planta uttrykk for R og Avr gener kan oppnås ved hjelp av forbigående uttrykk systemer som Agrobacterium tumefaciens –basert forbigående transformasjon (agroinfiltrasjon)16. Denne forbigående transformasjonen kan også brukes i kombinasjon med virale uttrykkssystemer (agroinfection)17,18.
For agroinfiltrasjon er det mest brukte middelet A . tumefaciens, et bredt vertsområde patogen av dikotplanter. En . tumefaciens inneholder en tumorinduserende (Ti) plasmid. Overfør DNA (T-DNA) fra en Ti plasmid vil omfordele seg til plantecellene etter at virulensmaskineriet til bakterien er aktivert. Dette kan utløses i sårede planteceller, av de frigjorte lavmolekylære fenolforbindelser og monosaccharaides i et litt surt miljø19. Virulensgenet aktiveres etter infiltrasjon av Agrobacterium suspensjoner i bladpaneler definert av store årer. Deretter vil planteceller i bladpanelene bli forvandlet og uttrykke transgene (e) som finnes i T-DNA-regionen.
Agroinfection er basert på sårinokulert Agrobacterium, som formidler translokasjon av et virus til planteceller. Viruset sprer seg deretter videre til tilstøtende plantevev, i fravær av Agrobacterium. For agroinfection kan flere plantevirus brukes. RNA-virus er ideelle vektorer for genuttrykk fordi de kan formere seg til svært høye nivåer i infiserte planter. Blant plante RNA-virus er Potato Virus X (PVX) mye brukt til effektoromics-skjermer. For å lette funksjonelle tester for et innsatt gen ble binære vektorer som inneholder PVX-genomet flankert av Blomkålmosaikkviruset 35S-promotoren og nopaline synthase terminator, klonet inn i T-DNA av A. tumefaciens20. Etter at T-DNA er overført til planteceller, transkriberes PVX-genomet i T-DNA fra 35S-promotoren. Deretter sprer viruspartikler seg systemisk i de infiserte plantene, noe som resulterer i uttrykk for det innsatte genet. Denne metoden basert på både Agrobacterium og PVX kalles PVX agroinfection.
Her viser vi eksempler for både agroinfiltrasjon og PVX agroinfection analyser. Som vertsplanter bruker vi potetkimplasma (Solanum seksjon Petota), for hvilke effectoromics tilnærminger har vært banebrytende og bevist vellykket3,4. Vi bruker også Nicotiana benthamiana, som er kjent som et modellanlegg i Solanaceous planter14,21,22.
Forbigående analyser som agroinfiltrasjon og agroinfeksjon er effektive metoder som er avgjørende for moderne molekylær plantepatologiforskning. Til tross for noen begrensninger oppfyller disse metodene etterspørselen etter effektiv og robust funksjonell analyse med høy gjennomstrømning i anlegg.
Agroinfiltrasjonssystemet er en mye brukt funksjonell analyse i en rekke plantearter. Agroinfiltrasjon letter levering av flere transgenes i samme celle med samtidig uttrykk for interagerende proteiner. Dette er fordelaktig for å rekapitlere R-AVR-relasjoner, ved å myntfiltrere Agrobacterium-stammer som uttrykker Avr-gener med stammer som uttrykker de matchende R-genene. Også for kjente R-AVR-par kan slike myntfiltreringer brukes som positive kontroller. Å inkludere slike kontroller er viktig fordi i noen plantegenotyper kan transformasjonseffektiviteten være under terskelen for å oppdage svar. Inkludert negative kontroller, for eksempel pt Agrobacterium-stamme som inneholder en vektor uten geninnsats, er også viktig for å avgjøre om en bestemt plantegenotype øker ikke-spesifikke forsvarsresponser på Agrobacterium. Denne funksjonen forekommer med en viss frekvens i potetkimplasma, og ikke alle Solanum-arter er godt egnet for dette Agrobacterium-baserteuttrykkssystemet. Generelt fungerer agroinfiltrasjonsanalysen veldig bra i N. benthamiana og de fleste potetgenotyper. I tillegg til effektoromics er det forskjellige andre potensielle applikasjoner for agroinfiltrasjonsteknikken, for eksempel produksjon av proteiner fra transgenes og proteinlokalisering i planteceller ved konfokal mikroskopi.
PVX agroinfection er et svært følsomt screeningsystem og vanligvis mer egnet for screening av høy gjennomstrømning. Siden Agrobacterium nå bare er lokalt til stede, er ikke-spesifikke svar på denne bakterien nå ikke veldig forstyrrende, da PVX-viruset overtar videre spredning av transgene. Planter kan imidlertid være motstandsdyktige mot PVX, eller montere ekstrem motstand (ER) respons, og i så fall er agroinfection-metoden ikke egnet. En annen begrensning ved PVX agroinfection-metoden er innsatsstørrelsen på genet av interesse. Observerte fenotyper av svar kan variere fra en intens svart nekrose rundt såret til svak nekrose nær inokulasjonsstedet. I både N. benthamiana- og Solanum-arter er PVX agroinfection anerkjent som mer følsom enn agroinfiltrasjon.
Med tanke på at den genetiske bakgrunnen til de forskjellige testede plantegenotypene kan ha noen begrensninger (se ovenfor), oppnår vi generelt lignende konklusjoner ved PVX-agroinfeksjon og agroinfiltrasjon. Disse resultatene er også sammenlignbare som oppnådd i andre analyser, for eksempel proteininfiltrasjoner29 og ELISA3. Tatt i betraktning fordelene og begrensningene til begge systemene, anbefaler vi at du bruker begge metodene for å enten utfylle hverandre eller bekrefte uavhengige resultater.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet støttes delvis av Wageningen University Fund (WUF), China Scholarship Council Program for Graduate Students og et NWO-VIDI-stipend 12378.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |