Agroinfiltration og PVX agroinfction er rutinemæssige funktionelle assays for forbigående ektopisk udtryk for gener i planter. Disse metoder er effektive assays i effectoromics strategier (hurtig resistens og avirulens gen opdagelse) og afgørende for moderne forskning i molekylær plantepatologi. De imødekommer efterspørgslen efter robust funktionsanalyse med høj gennemløb i planter.
Agroinfiltration og PVX agroinfction er to effektive forbigående udtryksanalyser til funktionel analyse af kandidatgener i planter. Det mest anvendte middel til agroinfiltrering er Agrobacterium tumefaciens, et patogen af mange dicot plantearter. Dette indebærer, at agroinfiltrering kan anvendes på mange plantearter. Her præsenterer vi vores protokoller og forventede resultater, når vi anvender disse metoder på kartoflen (Solanum tuberosum), dens relaterede vilde knoldbærende Solanum-arter (Solanum-sektionen Petota) og modelplanten Nicotiana benthamiana. Ud over funktionel analyse af enkelte gener, såsom resistens (R) eller avirulens (Avr) gener, er agroinfiltrationsanalysen meget velegnet til at opsummere R-AVR-interaktionerne forbundet med specifikke værtspatogeninteraktioner ved blot at levere R- og Avr-transgener til samme celle. Nogle plantegenotyper kan dog hæve uspecifikke forsvarsresponser på Agrobacterium, som vi observerede for eksempel for flere kartoffelgenotyper. Sammenlignet med agroinfiltration er påvisning af AVR-aktivitet med PVX-agroinfekt mere følsom, mere høj gennemstrømning i funktionelle skærme og mindre følsom over for ikke-specifikke forsvarsresponser på Agrobacterium. Men, uspecifikke forsvar til PVX kan forekomme, og der er en risiko for at gå glip af reaktioner på grund af virus-induceret ekstrem modstand. På trods af sådanne begrænsninger er agroinfiltration og PVX-agroinfekt efter vores erfaring både egnede og komplementære assays, der kan bruges samtidigt til at bekræfte hinandens resultater.
Effektoromik, en høj-throughput funktionel genomik tilgang er for nylig dukket op som et effektivt redskab til at identificere resistens (R) gener i afgrøder og matchende avirulens (Avr) gener af patogener1-4. I modsætning til den mere tidskrævende stabile transformation med R-gener er effectoromics-strategien baseret på forbigående analyse af patogengensekvenser.
Siden genomforskningstiden er genomer af plantepatogener bredt blevet udforsket. For eksempel for oomycetes, som omfatter de mest ødelæggende plantepatogener, er store samlinger af sekvenser blevet genereret og analyseret for gener, der spiller en rolle under interaktionen med planten5-10. En klasse af patogenproteiner repræsenterer effektorer, som manipulerer værtscellestruktur og -funktion enten for at lette infektion (virulensfaktorer) eller for at udløse forsvarsresponser (avirulensfaktorer)11-13. Ekspression af Avr-gener i planteceller, der indeholder R-gener, resulterer normalt i den overfølsomme celledødsrespons (HR)14,15. I planta udtryk for R og Avr gener kan opnås ved hjælp af forbigående ekspression systemer såsom Agrobacterium tumefaciens –baseret forbigående transformation (agroinfiltration)16. Denne forbigående transformation kan også anvendes i kombination med virale ekspressionssystemer (agroinfekt)17,18.
Til agroinfiltrering er det mest anvendte middel A . tumefaciens, et bredt værtsområde patogen af dicotplanter. A. tumefaciens indeholder en tumor-inducerende (Ti) plasmid. Overførsel af DNA (T-DNA) fra en Ti plasmid vil translokere ind i plantecellerne, når bakteriens virulensmaskineri er aktiveret. Dette kan udløses i sårede planteceller, af de frigivne lavmolekylære phenolforbindelser og monosaccharaides i et lidt surt miljø19. Virulensgenet aktiveres efter infiltration af Agrobacterium suspensioner i bladpaneler defineret af større vener. Derefter omdannes planteceller i bladpanelerne og udtrykkes de transgener, der er indeholdt i T-DNA-regionen.
Agroinfekt er baseret på sår-podet Agrobacterium, som formidler translokation af en virus til planteceller. Virussen spredes derefter yderligere til tilstødende plantevæv, i mangel af Agrobacterium. Til agroinfekt kan flere plantevirus bruges. RNA-vira er ideelle vektorer til genekspression, fordi de kan formere sig til meget høje niveauer i inficerede planter. Blandt plante-RNA-vira anvendes Potato Virus X (PVX) i vid udstrækning til effectoromics-skærme. For at lette funktionelle test for et indsat gen blev binære vektorer, der indeholder PVX-genomet flankeret af Blomkålsmosaikvirus 35S-promotoren og nopaline synthase terminatoren, klonet i T-DNA af A. tumefaciens20. Når T-DNA’et er overført til planteceller, transskriberes PVX-genomet i T-DNA’et fra 35S-promotoren. Derefter spredes viruspartikler systemisk i de inficerede planter, hvilket resulterer i ekspressionen af det indsatte gen. Denne metode baseret på både Agrobacterium og PVX kaldes PVX agroinfection.
Her viser vi eksempler på både agroinfiltration og PVX agroinfekt assays. Som vært planter vi bruger kartoffel kimma (Solanum sektion Petota), for hvilken effectoromics tilgange er blevet banebrydende og bevist vellykket3,4. Vi bruger også Nicotiana benthamiana, som er kendt som en model fabrik i Solanaceous planter14,21,22.
Forbigående assays som agroinfiltration og agroinfection er effektive metoder, der er afgørende for moderne molekylær plantepatologiforskning. På trods af visse begrænsninger imødekommer disse metoder efterspørgslen efter effektiv og robust funktionel analyse med høj gennemløb i planter.
Agroinfiltrationssystemet er en meget anvendt funktionel analyse i en række plantearter. Agroinfiltration letter leveringen af flere transgener til den samme celle med samtidig ekspression af interagerende proteiner. Dette er fordelagtigt for at opsummere R-AVR relationer, ved coinfiltrating Agrobacterium stammer, der udtrykker Avr gener med stammer, der udtrykker matchende R gener. Også for kendte R-AVR par, kan sådanne coinfiltrations bruges som positive kontroller. Det er vigtigt at medtage sådanne kontroller, fordi transformationseffektiviteten i nogle plantegenotyper kan være under tærsklen for at opdage svar. Herunder negative kontroller, f.eks. pt Agrobacteriumstamme, der indeholder en vektor uden genindsats, er også afgørende for at afgøre, om en bestemt plantegenotype rejser uspecifikke forsvarsresponser på Agrobacterium. Denne funktion forekommer med en vis hyppighed i kartoffelkimplasma, og ikke alle Solanum-arter er velegnede til dette Agrobacterium-baseredeudtrykssystem. Generelt agroinfiltration assay fungerer meget godt i N. benthamiana og de fleste kartoffel genotyper. Ud over effectoromics er der forskellige andre potentielle anvendelser for agroinfiltreringsteknikken, såsom produktion af proteiner fra transgener og proteinlokalisering i planteceller ved konfokal mikroskopi.
PVX agroinfection er et meget følsomt screeningssystem og typisk mere velegnet til screeninger med høj gennemløb. Da Agrobacterium nu kun er lokalt til stede, er uspecifikke reaktioner på denne bakterie nu ikke særlig foruroligende, da PVX-virussen overtager yderligere spredning af transgenet. Planter kan dog være resistente over for PVX eller montere ekstreme resistensresponser (ER), og i så fald er agroinfektmetoden ikke egnet. En anden begrænsning af PVX agroinfektmetoden er indsætningsstørrelsen af det interessante gen. Observerede fænotyper af reaktioner kan variere fra en intens sort nekrose omkring såret til svag nekrose nær podning stedet. I både N. benthamiana og Solanum arter, PVX agroinfection er anerkendt som mere følsomme end agroinfiltration.
Under hensyntagen til, at den genetiske baggrund for de forskellige testede plantegenotyper kan have nogle begrænsninger (se ovenfor), opnår vi generelt lignende konklusioner fra PVX-agroinfekt og agroinfiltrering. Disse resultater er også sammenlignelige som opnået i andre assays, såsom proteininfiltrationer29 og ELISA3. I betragtning af fordelene og begrænsningerne ved begge systemer anbefaler vi at bruge begge metoder til enten at supplere hinanden eller bekræfte uafhængige resultater.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet er delvist støttet af Wageningen University Fund (WUF), Kina Scholarship Council Program for graduate studerende, og en NWO-VIDI tilskud 12378.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |