ライブの検出<em>エシェリヒア·コリ</em> O157：PMA-qPCRによりH7細胞

Eの検出大腸菌 O157：ORF Z3276を使用して定量PCRによりH7 このアッセイの重要な要因の一つは、定量PCRに用いられるZ3276プローブの感度および特異性である。それは、 大腸菌のDNAのゲノムのいくつかのコピーと低く、検出することができます大腸菌 O157：H7、図1Aに示すように、 6主要な非O157 STEC株、O104を含め、検討120非O157菌株の表1に示したように、H4株、 サルモネラ 、 赤痢菌株 、交差反応性は、認められなかった。 定量PCRとのPMA処理の組み合わせインキュベーションE.大腸菌 O157：H7、暗所で5分間PMA（50 mM）を有する細胞、2分間光に曝すは、PMA処理条件のために選択した。さらに、当社は、PMA処理手順を変更しました。架橋工程において使用される種々の透明なマイクロチューブと比較して、96ウェルプレートを、より効率的であることが見出された最適な架橋効果と、露光プロセス中に試料管を多数取り扱いよりも便利に達する。 定量PCRでのPMA処理生細胞と死細胞からのDNAの増幅この定量PCRアッセイに死細胞からのDNAの増幅のPMA媒介性阻害の効果は、2つの連続10倍生または死細胞由来のDNAの希釈液を用いて、図1に示した。結果は、PMA（赤い曲線）およびPMAなし（青の曲線）で処理した生細胞から生成された曲線は線形で互いにほぼ同じに見えることを示している。わずかなCT値の差は、PMA処理は、定量PCRにおける生細胞のDNAの増幅にほとんど影響を及ぼさなかったことを示唆し、そしてPMAでPMA（ 図1A）なしで処理した生細胞の間に示された。しかし、15 – CT値差（32,000倍）は、PMAで処理された死細胞間およびPMA、デモなしで示されたPMA処理を効率的に死滅した細胞（ 図1B）からのDNA増幅を抑制することがnstrating。 定量PCRに住んでいて、死んだ細胞混合物からの生細胞の検出生細胞希釈（8×10 0から 8×10 6 CFU）の2つのセットは、生/死細胞の混合物から生細胞を検出するために、PMAでまたはPMAなしで処理した。定量PCRの結果（ 図2A）は、未処理サンプル（青いバー）ように処理生細胞（紫色のバー）の数に関連するものとしてのCT値の並列逆進歩的な傾向を示した。処理された生細胞は、未処理の生細胞のものよりも幾分高いCT値が得られた。 CT値で同様の逆プログレッシブな傾向は、 図2（b）にも同様のPMA（緑色のバー）で処置した生/死細胞の混合物中の生細胞の実数で観察された。また、CT値のこの減少傾向であった106死細胞の存在にもかかわらず、混合物中の生細胞数で観察した。これらの結果は、死細胞からのDNAの増幅が効率的にPMA処理により抑制されたのに対し、生/死細胞混合物のCT値は、単独で生細胞からDNAを表したことを示した。しかし、PMAで処理された生/死細胞混合物のCT値が変動し、 図2（b）の混合物中の生細胞数（黄色のバー）に反映しなかったし。 図1。生細胞と死細胞をPMAで、または定量PCRアッセイにおけるPMAなしで処理した。（A）のシリアルは、ライブEを 10倍に希釈した大腸菌 O157：H7の細胞希釈（8×10 0から 8×10 6 CFU）は、PMAでまたはPMAなしで処理した。CT値は、定量PCRアッセイにおける三つ組の平均CT値を表す。 （B）Q比較定量PCRアッセイでPMAでとPMAなしで処理生細胞と死細胞のDNA増幅の比較。 ΔRnのは、強度変化を蛍光に言及。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 図2。 。PMA-qPCRの細胞培養の10倍希釈液（8×10 0から 8×10 6 CFU）の4組によるライブ/死細胞の混合物からの生細胞の分化が示されているように行われました。第二の細胞希釈DNA抽出の前にあったか、または未処理の細胞希釈物（A）第一セットは、PMAで処理した。（B）8×10 6個の死んだ細胞を示すように生/死細胞混合物の二組を作るために細胞希釈の第3および第4のセットと混合した。細胞混合物の一組は、PMAで処理し、他のセットは、DNA抽出の前に、PMAなしで処理した。各バーは、±SD三連の実験の平均CT値を表す。 生体 血清型 試験した株の数 E.コリ 2006ほうれん草O157：H7アウトブレイクの分離株 186 2006タコベルO157：H7の分離株 58 2006タコスジョンO157：H7の分離株 11 他のO157からDMB株コレクション：H7のアウトブレイク 112 O104：H4 3 O26 18 O103 13 O111 24 O121 2 O45 5 O145 9 O113 2 O91 1 O55 9 その他 19 サルモネラ チフス菌 1 ニューポート 2 志賀赤痢菌 6 2 赤痢ソンネ 不明 2 赤痢菌 4 1 赤痢菌boydii 1 1 合計 481 TE.同定するためのリアルタイムPCRアッセイで検証するために使用できる1。 株大腸菌 O157：H7。