JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ambiente

Высокая пропускная Флуорометрический Измерение Потенциал почвы внеклеточных активности ферментов

Published: November 15, 2013
doi:
10.3791/50961
, , , , ,
1Natural Resource Ecology Laboratory,Colorado State University, 2Biosciences Division,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering,University of Colorado

Summary

Для измерения потенциальные темпы почвенных внеклеточных деятельности ферментных, синтетические субстраты, которые связаны с флуоресцентным красителем добавляются в образцах почвы. Активность фермента измеряется как флуоресцентный краситель высвобождается из субстрата фермента катализируемой реакции, где выше флуоресценции указывает на более деградации субстрата.

Abstract

Микробы в почве и других средах производить внеклеточные ферменты для деполимеризации и гидролизуют органические макромолекулы, чтобы они могли быть ассимилированы в энергии и питательных веществ. Измерение почвы микробного активность фермента является решающим для понимания экосистемных почвы функциональную динамику. Общая концепция флуоресценции фермента анализа является то, что синтетические C-, N-, или P богатых подложки связанные с флуоресцентным красителем добавляются в образцах почвы. Когда нетронутыми, меченые субстраты не светиться. Активность фермента измеряется как увеличение флуоресценции как флуоресцентные красители отщепляется от их субстратов, что позволяет им флуоресцировать. Измерения ферментов может быть выражена в единицах молярности или деятельности. Для выполнения этого анализа, почвенные растворы получают соединением почвы с буфером рН. Буфер рН (обычно 50 мМ ацетат натрия или 50 мМ Трис буфер), выбирается для конкретного константы диссоциации кислоты этого буфера (рКа), чтобы наилучшим образом соответствовать са почвыmple рН. Почвенные суспензии инокулируют в количестве не ограничивающем флуоресцентно меченого (например, C-, N-, или P-богатых) подложки. Использование почвенных суспензий в анализе служит для минимизации ограничений на фермента и диффузии субстрата. Таким образом, этот контроль анализа для ограничения различий в подложке скоростей диффузии, и почвенных условий рН таким образом, обнаружения потенциальных скорости ферментативной активности в зависимости от различий в концентрациях фермента (по образцу).

Флуоресценции фермента анализы, как правило, более чувствительны, чем спектрофотометрическими (т.е. колориметрических) анализов, но могут страдать от помех, вызванных примесей и неустойчивости многих люминесцентных соединений при воздействии света, так осторожность требуется при работе люминесцентных субстраты. Кроме того, этот способ только оценивает потенциальные активность ферментов в лабораторных условиях, когда субстраты не являются ограничивающими. С осторожностью следует применять при интерпретации данных, представляющий крест-сайт сравнения с различных температурах или типов почв, как на месте типа почвы и температуры могут влиять фермента кинетики.

Introduction

Внеклеточных ферментов (ЕЭС), производимые почвенных бактерий, грибков и архей участвуют в бесчисленных биохимических процессов, и играют центральную роль в обработке, стабилизации, и дестабилизации органического вещества почвы и круговорот питательных веществ в наземных экосистемах 1. Производя ЕЭС, почвенные микробы разлагают и трансформировать полимерного органического вещества на более мелкие растворимых молекул, тем самым освободить большую часть ранее связанные микро-и макроэлементы, что позволяет растения и микробы ассимилировать имеющиеся питательные вещества из почвы. ЕЭС были изучены в течение десятилетий, в первую очередь путем измерения их деятельности в лабораторных анализах 2-4, так как очень трудно непосредственно обнаруживать и количественно ферменты.

Внеклеточный активность фермента (EEA) наиболее сильно контролируется концентрации ферментов и соответствующих субстратов. Обилие отличается C-, N-и P-разрушающие ферменты в почвах контролируется многочисленных факторов язажимные микробной биомассы, общественные состав, наличие субстрата, микроклимат, и стехиометрические требования 5,6. Тем не менее, в точке КНО в пределах почвенной среды также зависит от температуры 7,8, связывание ферментов почвы глины и гуминовых свойств 2 и диффузии ограничений 9, которая в конечном счете регулируют активного фермента бассейн, с точки зрения размера, наличия подложки и текучесть кадров 10-12. Поэтому, признавая в точке почвенных условий имеет решающее значение при использовании лаборатория ферментных анализов интерпретировать функцию микробов почвы в различных экологических сайтов.

Многие различные классы ЕЭП может быть определена количественно в лабораторных анализов с использованием различных синтетических субстратов (см. "Список реактивов таблице" подробнее). Некоторые протоколы используют субстраты в анализах, которые соединены с колориметрической реакции, которые могут быть обнаружены с помощью спектрофотометра, шHile другие, в том числе протокола мы описываем здесь, используют субстраты, которые связаны с флуоресцентным фрагмента. Флуоресценции EE анализы, как правило, более чувствительны (на порядок величины), чем колориметрических анализов (которые используют хромогенный часть, присоединенную с синтетическим субстратом) 12-14. Чувствительность обнаружения EEA включает в себя два аспекта: один связан с количеством соединения интерес обнаружены и другие связанные с низкой обнаруживаемого потенциальной активности фермента. Методы колориметрического п-нитрофенол анализы (PNP), основанные можно найти в прошлом работает 15,16. Короче говоря, почвы (как правило, просеивают до <2 мм и сушат на воздухе) инкубируют при оптимальном или полем соответствующей температуре и рН. Скорость, с которой продукт реакции выпущен определяют колориметрически с помощью спектрофотометра 14. Чем выше чувствительность флуоресценции фермента анализов является отчасти из-за более чувствительного обнаружения флуорогенного разделения фрагменте, связанной с подстрокаели деградации, а не записи оптической плотности после отделения конкретного фрагмента хромогенного на определенной длине волны. Два наиболее часто используемых синтетических флуоресцентные показатели 4-метилумбеллиферона (MUB) 17 и 7-амино-4-метилкумарин (MUC) 18,19. MUC-связанные подложки обычно связаны с N-богатых синтетических субстратов, таких как белки и / или аминокислот. Флуоресцентные методы были впервые разработаны для водных образцов 20,21, и их применение к почвах требует контроля для тушения сигнала и помех 22,23. Анализы могут либо быть проведено с использованием традиционного "Настольные" химию с большими объемами, или могут быть использованы в микропланшета на основе протоколов, с увеличением пропускной способности, но, возможно, выше, погрешность измерения. В то время как существует несколько широко цитируемые протоколы для флуоресцентной детекции КНО в почвах 24, многие лаборатории используют тонкие вариации на этих протоколов, часто непреднамеренно или из-за разницыс в лабораторного оборудования или реактивов. Казалось бы небольшие различия в деталях протоколов может сильно влиять на измеряется КНО 25,26 и отсутствие стандартизированных ферментов делает его сложным для калибровки анализов между различными лабораториями. Таким образом, существует насущная необходимость для распространения подробных протоколов поощрения стандартизации ЕЭП анализов.

В нашем протокола, образцы почвы, получают путем объединения образцов почвы с буфером рН и гомогенизации с блендере. Суспензии затем инокулировали в количестве не ограничивающем флуоресцентно меченого C-, N-, или P-богатый субстрат, выбрана в зависимости от конкретного исследовательского вопроса, представляющего интерес. Использование почвенных суспензий в ферментных анализов служит в качестве контроля для минимизации ограничений диффузии субстрата. Флуоресцентные фрагменты резко охлаждают, пока они не отщепляется от их соответствующих субстратов, и таким образом активность фермента может быть обнаружен как флуоресцентный краситель освобождается от подложки Bу реакция фермента в качестве катализатора. Увеличивая интенсивность флуоресценции во времени отражает скорость ферментативной реакции, катализируемой.

Общая концепция флуоресценции фермента анализа является то, что синтетические субстраты связанные с флуорогенного фрагмента (флуоресцентным красителем), добавляют в пробах почвы 27. В ферментативном деградации субстрата, связь перерывах между флуоресцентным красителем и подложкой. Флуоресцентный краситель освобожден от подложки, следовательно, использовать в качестве косвенной оценки ферментной активности, и может быть определена количественно с использованием микропланшет-ридера для обнаружения интенсивности флуоресценции красителя. Короче, флуоресценция количественное осуществляется как освобожденная краситель излучает свет одной длины волны после поглощения света с другой длиной волны. Интенсивность флуоресценции регистрируется с помощью планшет-ридера, способного как возбуждения и обнаружения. Активность фермента может быть впоследствии количественно на основе известной Conce флуоресцентный краситель-ntrations подложки (т.е. известные количества синтетического субстрата добавлен в образцах почвы), а также ссылки на стандартную кривую разбавления интенсивности флуоресценции для конкретного фрагмента флуорогенного субстрата, используемого в анализе (например, 4-метилумбеллиферона (MUB) или 7-амино -4-метилкумарин (MUC)). (Пожалуйста, обратитесь к разделу протокола для конкретных деталей на активность ферментов количественного).

Лаборатория почвы ферментные анализы полезны для оценки функции микробного сообщества, но есть несколько технических ограничений, что пользователи должны признать 10. Флуоресцентные анализы могут страдать от помех, вызванных примесей и / или нестабильность многих люминесцентных соединений под воздействием света, поэтому необходима осторожность при обращении с люминесцентные подложек 25. Грунтовые частицы и / или органический материал в почвенных растворах может также столкнуться с интенсивности флуоресценции, известный как закалки эффекта 26.Кроме того, лаборатория ферментные анализы только оценивает потенциальные КНО в лабораторных условиях. В пробирке тесты измеряют КНО в условиях, где диффузия субстрата и изобилие неограничительных. Таким образом, данные, предоставленные этих анализов не может быть хорошим показателем КНО под в точке почвенных условий 10. В целом, активность фермента очень полезно для относительных сравнений, в которых типы почв похожи. Тем не менее, при использовании этого метода, чтобы сравнить работу среди почв, отличающихся по физическим или химическим свойствам, следует проявлять осторожность. Это связано с тем, что различия в типе почвы и температуры может существенно изменить состояние в точке ферментативной кинетике. Другим ограничением является то, что относительно небольшое субстраты являются коммерчески доступными (по сравнению с природной среды). Кроме того, синтетические субстраты, используемые для анализа ферментной активности относительно просты (легко растворим) может не совсем точно представляют почвы субстраты, присутствующие или availablе на месте. Другим фактором является то, что с помощью почвенных суспензий будет включать активность некоторых стабилизированных ферментов (т.е. иммобилизованных органическим веществом или глины), которые не могут быть активны в месте условий 2. Лаборатория ферментные анализы также не предоставляют информацию о настойчивости ферментов в почве (текучесть кадров фермент) или информации о конкретных видов микроорганизмов, которые производят почвенных ферментов.

Protocol

1. Анализ Настройка Этикетка 3 глубокими лунками: "Примеры", "MUB стандарт" и "MUC стандарт". Налейте каждый стандарт (MUB из 0, 2,5, 5, 10, 25, 50, и 100 мкм) и подложку (BG, CB, НАГ, PHOS, XYL А.Г. LAP) на отдельные чистые, prelabeled водоемов (ориентированных в строках) . Внесите соответствующий стандарт MUB в соответствующие лунки MUB стандартной пластине (табл. 1). Внесите 200 мкл 0 мкМ MUB в строке А MUB стандартной пластине. Внесите 200 мкл 2,5 мкм MUB в строке В MUB стандартной пластине. Внесите 200 мкл 5 мкм MUB в строке С MUB стандартной пластине. Внесите 200 мкл 10 мкМ MUB в ряда Д MUB стандартной пластине. Внесите 200 мкл 25 мкМ MUB в строке Е MUB стандартной пластине. Внесите 200 мкл 50 мкМ MUB в строке F из MUB стандартной пластине. Внесите 200 мкл 100 μМ MUB в строке г MUB стандартной пластине. Повторите шаги 1.3.1 – 1.3.8 для стандартов MUC в соответствующие лунки стандартной пластине MUC. Подготовка почвы суспензии для каждого образца почвы. Взвесьте 2,75 г поля влажную почву в блендер. Добавить 91 мл 50 мМ буфера. Смешайте на высоко в течение 1 мин. Налейте блендера содержимое в чистую стеклянную емкость, по крайней мере по ширине 8-канальной пипетки с мешалкой. Место на мешалки, смешать суспензии почвы на низком уровне. Пипетка 800 мкл суспензии почвы в первом столбце образца пластины (табл. 2). Повторите в 1-м столбце стандарта MUB и MUC стандартных пластин (табл. 1). Промыть блендера, мешалки и мешалки с DI H 2 O или буфер между проб почвы. Повторите шаги 1.4.1 – 1.4.7) для каждого образца, переход к следующей колонке с каждым последующим образца почвы (табл. 1 и2). Пипетки соответствующего субстрата (в данном примере, 200 мкМ концентрации) в соответствующие лунки образца пластины (табл. 2). Внесите 200 мкл BG подложки в строке А образец стекла. Внесите 200 мкл CB подложки в строке В Sample пластины. Внесите 200 мкл NAG субстрата в ряду С Sample пластины. Внесите 200 мкл PHOS подложки в ряда Д Образец пластины. Внесите 200 мкл XYL субстрата в ряду Е Образец пластины. Внесите 200 мкл AG субстрата в ряду F Пробы пластины. Внесите 200 мкл Нажмите субстрата в строке г образца пластины. Повторите шаги 1.5.1 – 1.5.7 для каждого образца пластины температуры инкубации. 2. Инкубация Планшеты Запечатайте глубоких скважин пластины («образец», «стандарт MUB" и "MUC стандарт4 ;) с пластинчатыми коврики. Переверните каждый (опломбированный) пластину вручную, пока раствор не тщательно перемешивают (~ 10x). Поместите пластины в соответствующем инкубаторе в течение необходимого периода времени инкубации (табл. 3). Запишите начальное время как часам 0. Также записать соответствующие времени инкубации, чтобы вы знали, когда, чтобы удалить пластину из инкубатора (табл. 3). В конце каждого периода инкубации центрифуги запечатанные пластин течение 3 мин при ~ 2900 х г. После сертификации, передать 250 мкл из каждой лунки инкубированных глубокие тарелки также в соответствующие лунки в черных плоскодонных 96-луночных планшетах (одна черная пластина будет использоваться для каждого инкубированной глубокий колодец плиты). Важно передать образцы из инкубированных глубокие тарелки а в те же лунки (т.е. А1 … А12, и т.д.) в черных плоскодонных 96-луночных планшетах (табл. 1, 2). 3. Люминесцентные Измерения наМикропланшетный Флуорометр Следуя инструкциям изготовителя для флуорометрического ридере используется, установите длины волны возбуждения до 365 нм и длине волны излучения 450 нм (или использовать соответствующие фильтры). Прочитайте три тарелки на флуорометра. Важно: образцы и стандартные пластины (т.е. MUB или MUC) должны быть считаны с помощью такого же усиления. Установите спектрофотометр для автоматического усиления и прочесть все таблички MUC и MUB Стандартные. Набор усиления в руководстве, и уменьшить значение от оптимального до ближайшего меньшего числа, округляется до ближайшего пяти, для каждого стандартного пластины. Повторите 2 раза для каждой пластины. Установите усиление на автоматический и запустите образец стекла. Снова запустите образец стекла вручную, чтобы соответствовать наибольшее усиление для каждого из стандартных пластин (т.е. MUB и MUC). 4. Анализ данных Введите стандартные данные флуоресценции кривая в электронную таблицу для MUB (Таблица 4а) И стандартного MUC (табл. 4b) Преобразование (мкм) до концентрации (мкМ) (табл. 4а и 4b). Для стандартных данных флуоресценции кривая каждого образца, вычислить наклон, у-перехват, и R 2 значения для MUB и Мюнхен (мкмоль) стандартные концентрации. Приемлемые R 2 значения должна превышать 0,98 для каждого образца (табл. 4а и 4б). Это может быть полезно для визуализации стандартных кривых в точечной диаграммы, с флуоресценции читает заговор в качестве зависимой переменной (Y-ось) и стандартной концентрации (мкмоль) нанесены в качестве независимой переменной (ось х) (рис. 1). Вы будете использовать стандартный наклон кривой MUB и MUC и ценности у-перехват для расчета образца + подложки исходные данные флуоресценции в потенциальных КНО. Необходимо сначала ввести образцы + субстрата необработанных данных флуоресценции в новую таблицу (Таблица 5а </strong>). Кроме того, необходимо будет ввести время инкубации (HR) и почвы сухой вес для каждого образца (Таблица 5б). Отметим, что временные значения, введенные в этом примере 3 ч, потому что образцы инкубировали при 25 ° С (табл. 3). Вычтите стандартной кривой перехвата значения за соответствующими значениями флуоресценции образца и затем разделить на склоне соответствующей калибровочной кривой (Таблица 5в). Чтобы достичь этого, изменить стандартное уравнение линии, чтобы решить для образца концентрации фермента (х), х = (YB) / м, где: [у = флуоресценции образца сырого чтения, б = перехват от MUB или MUC стандартной кривой; м = склона от MUB или MUC Стандартный кривая]. Умножение образец мкмоль, с этапа 4.3.1 выше, 91 мл (объем буфер, используемый в суспензии почвы) (Таблица 5d). Разделить полученное значение на этапе 4.3.2 на образце конкретных времени инкубации и массы сухой почвы (Таблица 5e): [фермент AMT. (& #956; моль) х 91 мл х инкубации (часы) х сухую почву (г) х 0,8 мл х 1000] Примечание: 0,8 мл-объем суспензии, используемой в каждую лунку и 1000 корректирует за фактический объем почвы в каждую лунку. Умножьте полученное значение на этапе 4.3.3 на 1000, чтобы получить желаемые единицы (нмоль деятельности / г сухой почвы / ч) (Таблица 5е).

Representative Results

Ферментные анализы могут быть использованы для количественной оценки потенциальных КНО и сравнить работу среди аналогичных образцов. Здесь мы представляем репрезентативные результаты от экспериментального исследования климата по сравнению почвы, опытных внешних условий климата (ACN) в почвах, которые подвергались воздействию повышенной концентрации СО 2 и отопления лечения (EHN) (рис. 2-6). Растительный покров во всех участках были характерны для северной смешанной прерий, где доминирует C4 траве Bouteloua гасШз (HBK) Лаг. и два C3 травы, Hesperostipa comata Трин и Rupr. и Pascopyrum smithii (Rydb.); около 20% растительности состоит из осоки и разнотравья. Более подробную информацию о описания сайта и поля эксперимента можно найти в справочниках 28-30. Почвы были собраны из двух различных глубинах (0-5 см и 5-15 см) в каждом из очистных участков с использованием сердечника 1,5 см в диаметре, чтобы оценить почвы КНО в ответ на измененное климата сonditions. В наших примерах (т.е. цифры 2-6), размер выборки (N = 3). Независимо от этого минимального размера образца, изменение является относительно небольшим в большинстве случаев (о чем свидетельствует планки погрешностей) и надежно отражает изменчивость в потенциальных КНО среди очистных участков. Дисперсионный анализ (ANOVA) и Таки постфактум множественных сравнений были использованы для выявления существенных сдвигов в активности фермента среди очистных участков и глубине почвы. Следующие показательные результаты были предоставлены чтобы продемонстрировать, как это с высокой пропускной, флуорометрический анализ может быть использован для тестирования (1) общий EEA в почвах, (2), как ЕЭП стехиометрии может свидетельствовать о процессах на уровне экосистем и (3) отношения между температурой инкубации и ЕЭП. Почва ЕАОС обычно изучал связать изменения в микробной функции для почвы питательных веществ; полезные показатели для оценки микробных требования питательных в ответ на изменение климата, растительное сообщество сhifts, и в более широком плане функционирования экосистем 31-33. ЕЭП стехиометрии совсем недавно был принят в качестве показателя для оценки почвы биохимический круговорот питательных веществ при пересечении экологическую стехиометрического теорию и метаболическую теорию экологии для оценки потенциальных диспропорций микробная питательных соответствующие условия окружающей среды 5. Многочисленные исследования показали, что широкие стехиометрические соотношения свидетельствуют о питательных ограничений роста 34-36, и, как питательных веществ в почве становятся ограниченными, микробы реагировать путем выделения метаболических ресурсов для производства специфических ферментов для приобретения дефицитных питательных веществ 37. Ecoenzymatic С: N: P отношения стехиометрии, следовательно, полезны для определения относительных сдвигов в потенциальных микробных требований сообщество питательных в ответ на различные экологические возмущений 5. Наконец, температура чувствительности КНО может быть полезен для оценки того, как почва микробное сообщество функциональное разнообразие, скорее всего, под влиянием температурных сдвигов <вир> 7,38. Фермент температуры чувствительность может широко варьироваться между почв для одного класса ферментов, и микробные сообщества, производящие ферменты продемонстрировали изменения в активности фермента, соответствующие сдвиги в климате от исторических условий 7. Таким образом фермент вопросы деятельности, связанной с тепловой экологии ЕЭС может быть полезным способом оценки микробных функциональные динамику и подземной экосистемных процессов в ответ на климат меняется 39,40. В этом примере потенциал C-, N-и Р-активности ферментов сбора анализировали на глубине 0-5 см почвы, не отличались по экспериментальной обработки (рис. 2а). Тем не менее, на 5-15 глубинах см почвы, несколько потенциальных КНО незначительно отличаться (рис. 2б). Например, C-разрушающие ферменты β-1 ,4-глюкозидазы и β-D-целлобиогидролазы были ниже в EHN участков (р ≤ 0,038; 2б) по сравнению с АКС участков. N и P шахтерalizing ферменты (β-1 ,4-N-ацетилглюкозаминидазы и фосфатазы, соответственно) также были ниже в EHN участков (р ≤ 0,012; рис. 2б) по сравнению с ACN на 5-15 глубинах см почвы. Расчет и построение сумму всех C-, N-, или P-велосипеде потенциальные КНО может быть полезным подходом наблюдать более широкие закономерности, касающейся возможных почвы C-, N-, и / или P-циклов (рис. 3). В этом примере, сумма β-1 ,4-глюкозидазы, β-D-целлобиогидролазы, β-ксилозидазы и α-1 ,4-глюкозидазы потенциальных КНО была рассчитана представлять потенциальную деятельность С велосипедные. Сумма β-1 ,4-N-ацетилглюкозаминидазы и L-лейцин аминопептидазы была рассчитана представляют собой потенциальные велосипедные деятельности N. Фосфатазы был использован для представления потенциальных видов деятельности P велосипедные. В этом примере, потенциальные КНО на общую C-, N-и P-велосипеде отклонялись ниже на графиках по сравнению с участков Сети на 5-15 глубинах см почвы EHN (FIGURe 3). Однако эта тенденция была единственным значительным для общего азота и фосфора велосипедных мероприятий (р ≤ 0,046; рис. 3). Грунтовые КНО существенно не отличаются между лечебными участков в 0-5 глубин см почвы (рис. 3). Результаты для этого примера показывают, различные тенденции в ферментной активности функциональной группы (например, C-, N-или п-разрушающие ферменты) среди участков обработки (ACN против EHN) в ответ на глубину почвы. Например, C-, N-и P-унижающие почвы КНО в окружающей участков (АКС) отклонялись выше при более низких глубинах по сравнению с почвами, подверженных повышенной концентрации СО 2 и отопления (EHN), который продемонстрировал обратную картину (рис. 3а-C ). Фермент стехиометрии это еще один полезный подход для оценки потенциальных ферментные активности в окружающую среду (рис. 4). Микробный спрос на питательные вещества определяется элементарной стехиометрии микробной биомассы по отношению к окружающей среденаличие питательных веществ 32. Кроме того, микробы продуцируют специфические ферменты (т.е. C-, N-, или P-разрушающие ферменты) для удовлетворения питательных потребностей в своих средах почвы, также называют экологической стехиометрии 41. Отношение потенциальных КНО является одним из способов оценки микробных требования питательных. Например, соотношение 1:1 между двумя фермента функциональные группы (например, в C: N приобретение питательных веществ) предполагает, что спрос на N является высоким по сравнению с спроса на C при рассмотрении микробной биомассы C: N коэффициенты на уровне общин , как правило, 8:01 42. В этом примере фермент почвы стехиометрии C: N, C: P или N: P деятельность значительно отличаются между лечебными участков на 0-5 см почвы глубиной (4а-C). Тем не менее, потенциал фермент C: P и N: соотношение P были выше в EHN участки по сравнению с участков Сети на 5-15 глубинах см почвы (р = 0,05; рисунках 4В и 4С). Это наблюдение предполагает, что существуетотносительно высокие КНО P минерализации по сравнению с С и N ЕЭП участки АКС (по сравнению с EHN) на 5-15 глубинах см почвы. Фермент C: N отношение Активность приобретение продемонстрировали аналогичную тенденцию к, что продемонстрированный общего С КНО с высшим C: N за счет более высоких потенциальных C КНО в Сети участков на меньшей глубине по сравнению с EHN (рис. 4а). Температура может сильно повлиять почвы КНО. Тем не менее, в типичных лабораторных анализов почвенных ферментов измеряются при одной температуре, что может не соответствовать в температурных условиях месте. Наш метод анализа флуоресценции фермента позволяет рассматривать в точке температурных эффектов путем включения нескольких температур лаборатория инкубации для сравнения. Использование лабораторных инкубации при нескольких температурах позволяет анализировать зависящие от температуры ферментативная кинетика данных с использованием Аррениуса сюжет и Q 10 расчетов. Аррениус участок используются для визуализации энергию активации, и нанесены насING логарифм активности фермента (зависит ось у) переменной в зависимости от обратной температуры преобразуется в градусах Кельвина (1 / K) на оси х (т.е. независимой переменной; фиг.5а-с). Энергия активации обычно определяется как минимальное энергии, необходимой для катализа химической реакции (т.е. ухудшить данную подложку на более мелкие продуктов). Для наших целей, энергия активации служит в качестве прокси для температурной чувствительности ферментных реакциях, катализируемых. Высшее энергия активации указывает температурную чувствительность фермента. Аналогичным образом, энергии активации (т.е. показатели 5d-F) непосредственно соответствуют Q 10 значений (т.е. 6а-с). Еще одно объяснение формул, используемых для расчета энергии активации и практическое применение можно найти во многих прошлом работает 40,43-45. Аррениуса, энергия активации, и Q 10 участков обеспечивают избыточную информацию и не долженвсе использоваться в той же рукописи представить данные для публикации (рисунки 5 и 6). Поэтому при использовании этих методов, необходимо выбрать наиболее подходящий тип участок для вашего температуре фермента – кинетика данных 10. Все типы участок (Аррениуса и Q 10) были представлены здесь в демонстрационных целях; предоставить наглядные примеры, как представить результаты ферментов. В наших примерах мы оценивали потенциальные кинетики ферментов для потенциального C-, N-и P-КНО как среди очистных участков на двух глубинах почвы (рис. 5; рис. 6). Открытие показало, что температурная чувствительность КНО достоверно не различалась среди очистных участков на обоих глубине почвы для энергии активации, как показано в участках аррениусовских (Цифры 5а-с) и соответствующих энергий активации (рис. DF) и (что не удивительно) для Q 10 PLOTS (в этом примере между 15 ° C и 25 ° C лабораторных инкубации; 6а-с). Это предполагает, что фермент кинетика не зависит от полевых экспериментальных процедур в данном исследовании. Таблица 1. Глубокий дизайн хорошо пластина для стандартных флуоресценции концентрации с образцами грунта. Шаблон для организации и стандарты погрузки флуоресценции (MUB или MUC) с образцами почвы в глубокую тарелку а до инкубации. Примечание: Столбцы представляют те же образцы почвы (800 мкл дополнений шламовых почвы). Градиент концентраций стандартных флуоресценции загружен для каждой строки (200 мкл) дополнений. Каждая ячейка представляет концентрацию стандартного флуоресценции плюс дополнения шламовые почвы. Например, S1 – S12 представляют образцы почвы (800 мкл суспензии почвы); MUB 0-100 мкм = 4-Methylumbelliferone концентрации (200 добавления мкл). В этом примере строка H открыт, и, следовательно, доступны включают более высокую концентрацию стандартного флуоресценции в случае необходимости. Это решение увеличить стандартные концентрации кривой может быть необходимо для более высокой потенциальной активности фермента (и / или концентрации субстрата используются) для ваших конкретных образцов почвы. Потенциал активность фермента для ваших образцов должны находиться в пределах стандартных значений кривой. Нажмите здесь, чтобы увеличить таблицу . Таблица 2. Глубокий дизайн хорошо пластина для образцов почвы с подложки. Шаблон для организации и погрузки образцы почвы и субстратов в глубокую тарелку а до инкубации. Примечание: Столбцы представляют те же образцы почвы (800 мкл такIL дополнения шламовые). Различные подложки загружаются на каждом ряду (200 дополнения мкл). Каждая ячейка представляет образцы почвы плюс подложки дополнение. Например, S1 – S12 представляют собой уникальные образцы почвы (800 мкл суспензии почвы). Субстраты (200 мкл) дополнения включают в себя: BG = 4-метилумбеллиферил β-D-глюкопиранозид; CB = 4-метилумбеллиферил β-D-целлобиозид; NAG = 4-метилумбеллиферил N-ацетил-β-D-глюкозаминида; PHOS = 4-метилумбеллиферил фосфат: XYL = 4-метилумбеллиферил-β-D-ксилопиранозид; AG = 4-метилумбеллиферил α-D-глюкопиранозид; и LAP = гидрохлорид L-лейцин-7-амидо-4-метилкумарин. В этом примере строка H открыт, и, следовательно, доступны, чтобы включить другой субстрат, чтобы оценить еще один потенциальный активность фермента при желании. Нажмите здесь, чтобы увеличить таблицу . Температура Время 4 ° C ~ 23 час 15 ° C 6 ч 25 ° C 3 часа 35 ° C 1,5 ч. Таблица 3. Температура инкубатора требуется для соответствующих периодов времени инкубации. Инкубации температуры и соответствующие периоды времени для процедуры фермент анализа. Таблица 4. MUB и MUC стандартные расчеты кривой. Демонстрирует, как организовать) MUB и б) MUC необработанные данные флуоресценции (мкмоль) впоследствии вычислить наклон, у-перехват, и R-квадрат значения. Для расчета склон, у-перехват, и R-квадрат значения из ваших стандартных концентрационных кривых, выберите (или участок)MUB и / или MUC необработанные данные флуоресценции в качестве зависимой переменной (Y-ось) и стандартной концентрации (мкмоль) в качестве независимой переменной (ось х). Примечание:. MUB = 4-метилумбеллиферона; MUC = 7-амино-4-метилкумарин Нажмите здесь, чтобы увеличить таблицу . Таблица 5. . Ферментные расчеты Активность Демонстрирует) организует образцы данных сырье флуоресценции и впоследствии выполнить шаги, необходимые (BF) для расчета КНО в: мкмоль деятельности / г сухой почвы / час. Примечание: S1 – S12 представляют собой уникальные образцы почвы. Субстраты включают: BG = 4-метилумбеллиферил β-D-глюкопиранозид; CB = 4-метилумбеллиферил β-D-целлобиозид; NAG = 4-метилумбеллиферил N-ацетил-β-D-глюкозаминида; PHOS = 4-метилумбеллиферил фоsphate: XYL = 4-метилумбеллиферил-β-D-ксилопиранозид; AG = 4-метилумбеллиферил α-D-глюкопиранозид и LAP = L-лейцин-7-амидо-4-метилкумарин гидрохлорид. Нажмите здесь, чтобы увеличить таблицу . Рисунок 1. MUB стандарт участок кривой. Рассеивания визуализация стандартных кривых с исходных данных флуоресценции в качестве зависимой переменной (Y-ось) и стандартной концентрации (мкмоль) в качестве независимой переменной (ось х). Рисунок 2. С, N и P велоспорт активности ферментов. Потенциальные КНО на Prairie отопления и повышенной концентрации СО 2 RUrichment (PHACE) сайт в контрольных участков (АКС: подвергались воздействию условий окружающей среды климата) и лечение участки (EHN: подвергается повышенной температуре и повышенной концентрации СО 2). Почвенных ферментов анализировали на а) глубины 0-5 см почвы и б) глубины 5-15 см почвы. Вертикальные полосы представляют среднее ± SE Примечание: ACN = окружающей среды – климата участков; EHN = повышенный СО 2 и нагревательные участки. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 3. Всего C, N и P велоспорт фермент стехиометрические отношения суммы потенциальных КНО, участвующих в приобретении) C, B) N и С) P-для обеих группах в эксперименте Phace на 0-5 см и 5. – 15 см почвы глубиной. Ввертикально по линии соответствуют средним арифметическим ± SE Примечание: ACN = окружающей среды – климата участков; EHN = повышенный СО 2 и нагревательные участки. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 4. Фермент стехиометрии для полного C, N, и P на велосипеде активности ферментов Активность фермента приобретение стехиометрических соотношениях на Prairie отопления и повышенной концентрации СО 2 обогащения (PHACE) сайта в контрольных участков. (АКС: подвергается окружающей климатические условия) и лечения участков (EHN: воздействию повышенной температуре и повышенном CO 2). Всего почвы) С: N, б) С: Р и в) N: P построена для обеих группах в 0-5 см и 5-15 глубинах см почвы. Вертикальные линии соответствуют средним арифметическим ± SE Примечание: ACN= Окружающей среды – климатические участки; EHN = повышенный СО 2 и нагревательные участки. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 5. . Всего C, N и P велосипедные энергии активации фермента Температурная чувствительность потенциальных КНО отображаются с помощью Аррениуса для полного а) С, В) N, и в) Р ферментов, разрушающих;, а также соответствующие значения энергии активации для общей г) С , е) N, и е) Р ферментов, разрушающих среди очистных участков и глубине почвы на прерии отопления и повышенной концентрации СО 2 обогащения (PHACE) сайта. Вертикальные полосы для энергии активации (т.е. DF) представляют среднее ± SE Примечание: ACN =mbient – климатические участки; EHN = повышенный СО 2 и нагревательные участки. Для публикации, важно отметить, что автор, как правило, по своему усмотрению представлять либо Аррениуса (т.е. АС) или значения энергии активации (т.е. DF), но не оба сюжета-типы. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 6. Всего C, N и P велоспорт фермент Q10 (15-25 ° С). Температурные чувствительности потенциальных КНО измеренных как Q 10 основывается на лабораторных инкубации при 15 ° С и 25 ° С для полного а) С, В) N, и в) Р ферментов, разрушающих среди очистных участков и глубине почвы в Prairie отопления и повышенной концентрации СО 2 </ Суб> Обогащение (PHACE) сайт. Вертикальные полосы для Q10 представляют среднее ± SE Примечание: ACN = окружающей среды – климата участков; EHN = повышенный СО 2 и нагревательные участки. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

Лаборатория основе измерения потенциальных КНО почвы может обеспечить важную информацию о микробных ответов на их неживым окружением, а также их последствия для функционирования экосистем. Результаты этого примера набора данных предполагают, что существуют минимальные различия в активности фермента почвы или кинетики среди лечения климат участков. Тем не менее, обратные тенденции среди участков поощрять дальнейшее исследование ковариат которые могут повлиять на производство микробных КНО, таких как влажность почвы, рН почвы или роста растений. В целом, оценки КНО в плане (1) общей ЕЭП в почвах, (2) ЕЭП стехиометрии (3) энергии Аррениуса / активации, и (4) Вопрос 10 предоставляет широкий спектр подходов, которые могут свидетельствовать о процессах на уровне экосистем из которых можно надежно охарактеризовать экосистемных почвы функциональную динамику.

Высокая пропускная способность флуоресценции основе ЕЭП анализы являются полезным инструментом, который широко используется для изучения потенциальных КНО в почвах идругих средах. Важно отметить, что возможные виды деятельности отражают размер фермент бассейн, но не сами по себе количественно фермента производства или сменяемости 46. Хотя техника является относительно простым, казалось бы, незначительные различия между протоколами лабораторных может помешать сопоставимость результатов 13. К сожалению, мы в настоящее время не имеют подходящие стандартные положительные элементы управления для КНО. Использование стехиометрических соотношениях является одним из подходов для преодоления этих проблем. В противном случае, появление методов высокой пропускной продвинулась изучение ферментов в окружающей среде 4. Тщательное интерпретация данных, генерируемых этих анализов может выяснить важные тенденции в микробной активности.

Надежность протокола связано с возможностью выбора для условий в конкретных образцов, но это также может привести к ограничениям. Ряд модификаций будут обязаны обеспечить образцы точно измерить для отдельные сайты поля:

Буфер

Буфер выборе будет зависеть от рН почвы. Буферизация также стабилизирует интенсивность флуоресценции флуоресцентных стандартов, который очень зависит от рН 27,47. Буфер рН, что мы обычно используем, чтобы сделать суспензию почвы является 50 мМ ацетат натрия или Трис-буфер, который выбран для конкретной кислоты константы диссоциации этого буфера (рКа) для наилучшего соответствия почвы – уровень рН образца. Ацетат натрия имеет рКа 4,76 и трис имеет рКа 8,06 таким образом количество этих двух буферов будет варьироваться, чтобы достичь желаемого рКа для отдельного образца. Фосфатный буфер (рКа = 7,2) был предложен для нейтральных / слегка основных почв. Тем не менее, мы предупреждаем, чтобы проверить на аналитической вариабельности предварительных исследований, прежде чем использовать этот буфер, а высокие концентрации фосфатов может помешать активности фермента.

Обращение и хранение люминесцентных субстратов

jove_content "> флуоресцентные анализы могут страдать от помех, вызванных примесей и / или нестабильность многих люминесцентных соединений под воздействием света, поэтому необходима осторожность при обращении с флуоресцентные субстраты. Мы настоятельно рекомендуем свести к минимуму любые освещенность в флуоресцентно меченных субстратов и MUB и MUC стандарты . Использование янтаря стеклянные бутылки или покрытие стекла и контейнеры для подготовки и хранения люминесцентных субстратов и стандарты настоятельно рекомендуется; алюминиевой фольги, чтобы обернуть стеклянную посуду и контейнеры хорошо работает Аналогично, эффективно прививать тарелки и передачи в темных инкубаторов лучшие практики Мы рекомендуем.. хранения подложек и стандарты (-20 ° С) не более чем на два месяца (в то время защищая их от света) и оттаивания субстраты (5 ° С) ~ 24-48 ч до начала ферментного анализа (ы).

Дизайн и репликации

Для лучшего счета для хорошо к изменениям образца также, реализации Negativе управления анализа и (если возможно) анализ повторяет рекомендуется. Изменение обычно происходит из-за различий в размере частиц почвы в каждую лунку и ошибок пипеток. Таким образом, сильное перемешивание и хорошая техника пипетирование существенно минимизировать скважины к скважине вариации. Кроме того, мы настоятельно рекомендуем реализации негативное пробирного контроля (буфера + раствор субстрата) для мониторинга состояния основания несоответствия в течение долгого времени. Это можно легко контролировать при чтении ферментные пластин путем сравнения негативные контрольные лунки (мы обычно используем последнюю колонку на 96-луночных планшетах с). Отрицательные контроли подложки, как правило, стабильна, поэтому возрастает сигнала значительно выше предела обнаружения, это свидетельствует о загрязнения или нестабильности подложки, требует замены подложки и / или стандартных растворов.

Чтобы максимально увеличить пропускную способность, наш протокол включает в себя несколько потенциальных КНО в одном глубокой микропланшет а, хотя другие протоколы выполнения одного типаАнализ за тарелку (то есть один подложки за тарелку), так как разные КНО происходят с разной скоростью. Несмотря на это, оптимизация фермент должны выполняться на почвах перед выполнением этой высокой на протяжении подхода или единого подхода пластины. Несколько субстратов может быть использован на одной пластине если скорость реакции равнонепротиворечивы для каждого фермента в пределах периода времени инкубации.

Наш протокол рекомендует ~ 2.75 г почвы, чтобы сделать суспензии решение, а ~ 1 грамм рекомендуется в других протоколов 24. Мы полагаем, что с помощью больше почвы (если возможно) является эффективным подходом к улучшению захвата внутри выборки изменения почв в ферментных уровней активности. В этом протоколе, мы инкубировать 800 мкл суспензии почвы с 200 мкл субстрата, в то время как другие только инкубировать 200 мкл суспензии почвы с 50 мкл субстратов. Это просто функция расширения, что в конечном счете не меняется измеренное деятельность. Есть также практические преимуществадля использования больших объемов. Один из них, это проще, чтобы избежать почвы частиц наконечник пипетки при вводе в соответствующие черные пластины с плоским дном 96-задолго до записи интенсивности на флуорометра. Во-вторых, дополнительный объем полезно в случае случайного разлива при передаче черные пластины плоскодонные 96-луночные к флуорометре перед записью ферментов, связанных интенсивность флуоресценции. Даже незначительные отклонения в объеме, существенно снизит флуоресценции среди скважин. И наконец, в связи с высокой пропускной природы этом протоколе, мы обычно выбирают полагаться на экспериментальной репликации представлять изменение уровней активности ферментов вместо выполнения анализа репликацию. Это всегда лучший способ включения аналитических повторов, но на практике, мы считаем, наш протокол обеспечивает сбалансированный компромисс между аналитических и экспериментальных повторов при ограниченных ресурсах. Кроме того, наш подход использует относительно более хорошо гомогенизируют почвы (2,75 г) в анализе 25, которые присущиntly уменьшается в-почвенных изменений. Решение использовать аналитические повторов должны быть тщательно продуманы, проверяя для аналитического ошибки в предварительных исследований 48. Тем не менее, мы рекомендуем, что экспериментальные проекты с менее чем 4 лечебно-группы повторов должны серьезно рассмотреть использование анализа повторяет.

Почва, буфера Объемы и оптимизация концентрация субстрата

Буфер почвы: субстрат отношение концентраций является важной переменной, которая сильно влияет на измеренное флуоресценции при выполнении ферментные анализы. Количество почвы в суспензии добавили в анализа или концентрации субстрата возможно, должны быть скорректированы в зависимости от активности ферментов в образце почвы. Суммы, выбранные для этого примера были основаны на предыдущем тестировании этих почв для того, чтобы доступность субстрата непредельных, и что мы измерения максимально возможные ставки в условиях анализа (V макс) 44,45. Тем не менее, для образцов почвы, которые имеют высокие концентрации ферментов, количество почвы или концентрации субстрата должна быть увеличена. Мы нашли, что увеличение концентраций субстрата (и корректировки стандартной кривой соответственно) могут влиять линейность кривой. Поэтому мы рекомендуем снижение количества почвы и / или пропорциональные коррективы в буфер объемы по мере необходимости. Несмотря на это, важно оптимизировать концентрацию субстрата для каждого типа почвы анализировали потому измеренные КНО может отличаться на порядок больше, между насыщенными и суб-насыщенных концентрациях субстрата 26. Поэтому различия между экспериментальными лечения (и т.д.) чувствительны к типу II статистическая погрешность и меньше шансов быть обнаружены на суб-насыщая условиях и статистической погрешности 27,35. Для оптимизации концентрации субстрата, предварительные ферментные анализы должны выполняться на репрезентативных проб почвы, используя широкий диапазон концентраций субстрата. Послезаписи флуоресценции, просто сюжетные данные (аналогично стандартному примеру кривой; Рисунок 1) определить концентрацию субстрата (ось Х), соответствующий фермент активности (ось у), где уровни наклона прочь (~ 0). Кроме того, концентрация субстрата, соответствующего точке, где уровень наклона от (~ 0) является хорошим показателем оптимальной концентрации субстрата для этой конкретной почвы.

Этот анализ измеряет флюоресценцию в конечном счете в течение определенного времени производимого флуорогенного фрагменту, который расщепляется с подложки в результате ферментативной-опосредованной подложки деполимеризации. Таким образом, шаг 5 (подложка дополнение) имеет решающее значение и должна быть выполнена как можно более эффективно, чтобы минимизировать время между когда субстрат добавляется в почвах и когда анализы инкубируют. Кроме того, как только субстрат вступает в контакт с образцом, ферментативные реакции начнет происходить. Мы рекомендуем использовать многоканальныйпипетки по этой причине. Настоятельно рекомендуется, чтобы стать эффективным с помощью пипетки многоканальный до дня вы выполняете свои ферментные анализы. Чтобы достичь этого, вы можете практиковать пипетирование водой, пока вы не можете легко перенести объемы в 96-луночных планшетах в с пипетки.

Почва Тушение

Тушение предусматривает уменьшение интенсивности флуоресценции, вызванной частицами и / или органического материала в почве суспензий-инкубации 26. Тушение можно влиять путем регулирования почву: коэффициенты буферные 25. Благодаря фоновой флуоресценции от отдельных образцов, важно, чтобы запустить стандарты с образцами для учета фона (закалка) флуоресценции. Хотя некоторые протоколы используют единую концентрацию после тестирования, что сигнал является линейным, мы настоятельно рекомендуем реализации стандартный контроль гашения для каждого образца, чтобы лучшего контроля за последствия тушения. Невыполнение этого требования приведет к подставкеARD кривая не применяется к образцу, и неверной оценки ферментативной активности. Добавление стандартов в почвенных растворах не чувствительны ко времени, поскольку стандарт добавление не влияет на фоновой флуоресценции образца.

NaOH дополнение

Добавление NaOH используется в некоторых протоколах для оптимизации измерений флуорометрические активность фермента, так как флуоресцентный краситель высвобождается из синтетических субстратов демонстрирует пик флуоресценции при рН> 9,0 26,49. При рассмотрении это предложение, концентрация NaOH необходимо суспензии почвы рН (т.е. рН> 9) будет изменяться в зависимости от конкретной почвы и буфер рН использовали 26. Тем не менее, другие утверждают, что NaOH может не быть необходимым, поскольку интенсивность сигнала, как правило, очень высока даже при более низком рН, и, поскольку она вводит дополнительный источник погрешности измерений. Например, эффект NaOH добавок на суспензионной рН и, таким образом, MUB или MUC fluoreScence изменения с течением времени 25. MUB связанные субстраты как было показано, демонстрируют последовательное увеличение флуоресценции в течение 20 мин следующую NaOH дополнения до уровней конусность, в то время MUC продемонстрировал устойчивый уменьшилось флуоресценции до 60 мин 26. Таким образом, важно, чтобы стандартизировать время между добавлением NaOH и измерения флуоресценции. С другой стороны, если уровни флуоресценции достаточно обнаружить без того, проведение анализов без добавления NaOH был предложен в качестве одинаково приемлемой альтернативы 26.

Температура

Температурная чувствительность должны быть приняты во внимание при принятии решения температуры инкубации. Если первичный интерес понимания фермента кинетики, используя три или более температуры, как показано с помощью Аррениуса (в разделе результатов) является надежным подходом. Если сайт образец имеет характерный низкую температуру например многолетнемерзлых грунтов, то Длительностин инкубации возможно, должны быть расширены, чтобы обеспечить ферментов, чтобы реагировать в более холодных температурах инкубации. Хотя традиционные фермента кинетика предполагает, что повышение температуры приведет к увеличению активности фермента, было обнаружено, что ферменты могут быть конкретного участка с точки зрения чувствительности 50 температуры. Поэтому, чтобы понять по конкретным участкам активности фермента потенциал очень важно, чтобы температура инкубации и продолжительность быть скорректирована с учетом значения поля сайта.

Вывод

ЕЭС являются важнейшими факторами биогеохимических процессов в почвах, и, таким образом, мы должны быть в состоянии измерить их деятельности. Есть много проблем в измерении КНО в почвах, в том числе помех и торможения. Несмотря на эти проблемы, стандартизированные протоколы (как описана здесь) может быть универсально применен для измерения КНО для широкого спектра ферментов. Хотя это довольно легко генерировать качественные данные следующие этих протоколов, впретации этих данных в экологическом контексте требует тщательного рассмотрения, что эти анализы действительно измерения, и как КНО в условиях анализа могут отличаться от тех, под на месте условий.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта публикация была финансируется ферментов в окружающей исследовательского Координационного сетевых исследований при поддержке Национального научного фонда США (DEB # 1021559). Это исследование было поддержано Национальным Научным Фондом США (DEB # 1021559), а также департамента США в Управление энергетики наук (биологических и экологических исследований). Любые мнения, результаты, заключения или рекомендации, выраженные в этом материале, являются таковыми из авторов и не обязательно отражают точку зрения США NSF.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalogue number Comments
Reagents:
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) Sigma Aldrich M9766 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) Sigma Aldrich M3633 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) Sigma Aldrich M6018 Cellulose degradation
L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) Sigma Aldrich L2145 Protein degradation
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) Sigma Aldrich M2133 Chitin degradation
4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) Sigma Aldrich M8883 Phosphorus mineralization
4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) Sigma Aldrich M7008 Hemicellulose degradation
4-Methylumbelliferone (MUB) Sigma Aldrich M1381
7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) Sigma Aldrich A9891
50 mM Sodium acetate anhydrous buffer Fisher Scientific S210-500 acidic and neutral soils
50 mM Tris base buffer Fisher Scientific BP154-1 basic soils
Equipment
Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs Fisher Scientific 14-512-65 pipetting reservoir
Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel Fisher Scientific 13-684-265 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl
TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips USA Scientific 1112 – 1720 10 racks of 96 tips (960 tips)
Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. Fisher Scientific 11-100-100SH Lab disc magnetic stir plate
Waring blender Fisher Scientific 14-509-7P Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container
BRAND Dispensette III bottle-top dispensers Fisher Scientific 13-688-231 Dispenser; range: 5-50 ml
Wheaton Unispense μP peristaltic pumps Fisher Scientific 13-683-7 Optional dispenser
Fisherbrand magnetic stir bar Fisher Scientific 1451363SIX Used to stirr soil slurry afer blending
Pyrex glass bowls World Kitchen 5304218 Pyrex 10 oz rimmed custard cup
Costar 96-well black solid plates Fisher Scientific 07-200-590 Used for plate reader step
Costar 96-well assay blocks Fisher Scientific 07-200-700 V-bottom; 2 ml; sterile
Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats Fisher Scientific 14-387-93 Sterile 96-well cap mat for square wells
Centrifuge equipped with holders for deep-well plates Thermo Scientific 3121 Centra-GP8 (this model is no longer available)
Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader Tecan 30016058 Plate reader (this model is no longer available)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Burns, R. G., Dick, R. P. . Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, (2002).
  2. Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
  3. Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
  4. Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
  5. Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
  6. Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
  7. Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R., Shukla, G., Varma, A. . Soil Biology. 22, 245-258 (2011).
  8. Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
  9. Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
  10. Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
  11. Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
  12. Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
  13. Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
  14. Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O., Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. . Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. , (1999).
  15. Tabatabai, M. A., Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. . Methods of Soil Analysis. 2, 903-947 (1994).
  16. Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
  17. Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
  18. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
  19. Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
  20. Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER – MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
  21. Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
  22. Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
  23. Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
  24. Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
  25. DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
  26. German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
  27. Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
  28. Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
  29. Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
  30. Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
  31. Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
  32. Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151 (2006).
  33. Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P., Shukla, G., Varma, A. . Soil Biology. 22, 229-243 (2011).
  34. Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
  35. Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
  36. Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
  37. Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
  38. German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis – Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
  39. German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
  40. Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
  41. Sterner, R. W., Elser, J. J., Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. , 179-230 (2002).
  42. Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
  43. Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279 (1982).
  44. Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
  45. Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
  46. Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
  47. Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79 (1986).
  48. Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
  49. Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
  50. Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).

Tags

Soil Extracellular Enzyme ActivitiesFluorometric MeasurementSoil Microbial Enzyme ActivityFluorescence Enzyme AssaySoil SlurriesFluorescently Labeled SubstratesPotential Enzyme ActivitySoil Ecosystem Functional DynamicsEnzyme Kinetics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bell, C. W., Fricks, B. E., Rocca, J. D., Steinweg, J. M., McMahon, S. K., Wallenstein, M. D. High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities. J. Vis. Exp. (81), e50961, doi:10.3791/50961 (2013).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image