Tymus är det organ i vilket T-cellutveckling sker. Dess relativa och absoluta storlek minskar med åldern när det blir successivt ersätts av fett även thymic aktivitet fortfarande kan detekteras i ålderdomen. Dess betydelse för immunsvar visades i början av 1960-talet ^1.

Den T-cellrepertoaren formas genom samverkan mellan T-cellreceptorer med peptid-MHC-komplex på olika typer av tymus-APC, som ger överlevnad eller död cues att utveckla T-celler, vilket resulterar i en funktionell och i stor utsträckning självtoleranta T-cellrepertoaren ^2.

Ungefär 98% av cellerna i människo tymus utvecklar T-celler kallade tymocyter. De återstående 2% bestå av ett antal olika celltyper, inklusive en variation av TEC (kortikal, medullär, subkapsulär), myeloida och plasmacytoid DC (MDC, PDC), makrofager, B-celler, mogna åter cirkulerande T-celler, granulocyter, fibroblasts, endotelceller och mycket sällsynta epiteliala celler med en expressions fenotyp som liknar det av celler från andra vävnader, såsom muskler, neuroner och respiratoriskt epitel (Figur 1). Av dessa TEC och DC är de stora APC typer som finns i en normal tymus. Under senare år har reningen av dessa APC typer för kultur och molekylär profilering fått mer och mer intresse. På grund av sin låga frekvens, isolering av någon av dessa celltyper för detaljerad analys kräver ett effektivt, reproducerbart och kostnadseffektiv procedur. Den metod som presenteras här är en ändring från tidigare publicerade studier ^3,4.

Som med någon annan vävnad kan cellutvinning från tymus uppnås genom enzymatisk sönderdelning av den cell-cell-och cell-matrix-interaktionsnätverk, för att erhålla en suspension av enstaka celler. Det finns vissa parametrar som god dissociation effektivitet, cell avkastning, cellviabiliteten och bibehållande av cell surface markörer som är avgörande och måste optimeras för den framgångsrika isoleringen av dessa sällsynta cellpopulationer.

I detta protokoll, är isolering av DC och TEC grupper utförs genom att göra en encelliga suspension av vävnaden genom mekanisk störning och enzymatisk nedbrytning. Vi använder kollagenas A från Clostridium histolyticum, som har en balans mellan olika enzymaktiviteter, för att bryta ner den infödda kollagen som håller vävnaden tillsammans. DNas ingår i enzymlösningen för att minska cell aggregering grund fri DNA från döda celler (tymocyter är mycket känsliga). Vi erbjuder även ett alternativ till den typiska enzymatisk vävnad matsmältningen involverar mekanisk och enzymatisk vävnadsbehandling med bistånd av en vävnad dissociator. Den enda cellsuspension underkastas sedan en enda Percoll-densitetscentrifugering för anrikning av lågdensitetsfraktionen (LDF) av celler. Ur denna fraktion av celler, kan DC isoleras genom färgning feller DC-ytmarkörer (dvs. CD11c ⁺⁾ och med hjälp av magnetisk separation eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Till skillnad från de lymfoida celler som innefattar den stora majoriteten av celler i tymus, behöver TEC inte uttrycka CD45 vid höga nivåer, men är positiva för epitelial celladhesionsmolekyl EpCAM. CTEC kan särskiljas från medullära TEC genom uttrycket av en ännu odefinierad antigen som igenkännes av den CDR-2 (kortikal dendritisk retikulocyt-2) antikropp ^4,5 och något lägre EpCAM expression. Differential co-uttryck av EpCAM och CDR2 möjliggör effektiv isolering av dessa TEC grupper via höghastighetscellsortering ^6.

Protokollet presenteras här är optimerad för human tymusvävnad. Varaktigheten av förfarandet beror på mängden av vävnad och förmågan hos den som utför experimentet liksom hastigheten på cellsorterare, om FACS-sortering användes. Normalt kan protokollet för isolering av DC vara avslutad inom 5-6 H och för isoleringen av TEC i 8-10 timmar. Isoleringen av DC och TEC grupper från tymusvävnad är tidskänsliga. Ju snabbare isoleringsförfarandet, desto bättre tillstånd hos cellerna. Slutligen kan de isolerade cellerna kan användas för ytterligare undersökningar såsom jämförande studier av mRNA och proteinuttryck, PCR-experiment, proteinisolering, molekylär profilering (dvs transkriptomik, mikro-RNA-analys) samt cellodlings ^6.

Ethics Uttalande

För att kunna arbeta med mänsklig bräss vävnad behöver forskaren att få godkännande från den lokala etiska kommittén eller ansvariga myndigheter samt ett informerat skriftligt samtycke av givaren (eller oftast hans eller hennes föräldrar, eftersom vävnaden erhålls vanligtvis från sändare barn). Dessutom bör alla mänskliga vävnader hanteras som potentiellt smittsamma och lämpliga åtgärder bör vidtas, till exempel att arbeta med handskar, osv.