זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי

1. הכנת דגימת חלבון (מתואר הליך אופייני להפקת חלבונים מתרבית התאים) מניחים את צלחת תרבות התא HeLa בקרח ולשטוף את התאים עם מלח קר כקרח Tris-אגירה (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl). לשאוף את TBS, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר לכל 100 מ”מ צלחת קר כקרח מאגר RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ”מ NaCl, 1% NP-40, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% SDS) בתוספת מעכבי פוספטאז ופרוטה. לגרד תאים חסידים את המנה באמצעות מגרד תא פלסטיק קר; מעבירים בעדינות את השעיית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה מקולק מראש. לשמור על תסיסה מתמדת במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס על מסובב. ספין ב 16,000 x גרם במשך 20 דקות בצנטריפוגה 4 °C (60 °F). מוציאים בעדינות את הצינור מהצנטריפוגה ומניחים על הקרח. מעבירים את הסופרנט לצינור טרי שנשמרו על קרח, וזורקים את הכדור. הסר נפח קטן (10-20 μl) של lysate לבצע בדיקה חלבון. קבעו את ריכוז החלבון עבור כל דגימה באמצעות ערכת מבחני RC DC. במידת הצורך, יש לאסוף את דגימות החלבון לאחסון לטווח ארוך ב-20°C(20°C). מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים גורמים להשפלת חלבונים ויש להימנע מהם. קח בערך 20 מיקרוגרם של כל מדגם, להוסיף נפח שווה של 2x Laemmli מאגר מדגם (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% גליצרול, 0.004% כחול ברומופנול, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8). מחממים כל תא lysate במאגר מדגם ב 95 °C (70 °F) במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 16,000 x g במיקרוצנטריפוגה במשך דקה. 2. ג’ל אלקטרופורזה עם ג’לים ללא כתמים (~ 30 דקות) קח קריטריון TGX כל ג’ל precast ללא כתמים KD (ג’ל בפורמט midi), להסיר את המסרק ואת הקלטת מתחתית הקלטת. הנח את הקלטת בתא הקריטריון ומלא את תא החיץ העליון המשולב במאגר פועל של 60 מ”ל (25 מטר טריס, גליצין 190 מ”מ, 0.1% SDS, pH 8.3). יש לשטוף את הבארות באמצעות חיץ פועל. מלא כל מחצית ממיכל החיץ התחתון במאגר פועל של 400 מ”ל לקו המילוי המסומן. טען את דגימות החלבון ואת סמני החלבון המתאימים. מניחים את המכסה על המיכל, מיישרים את תקעי הבננה המקודדים בצבע עם שקעים מתאימים על המכסה. הפעל את הג’ל במשך ~ 30 דקות ב 200 V או 20 דקות ב 300 V. 3. הדמיית ג’ל ללא כתמים באמצעות מערכת MP Chemidoc לבדיקת איכות הפרדת חלבונים (~ 5 דקות) הסר את קלטת הג’ל מהתא. השתמש בכלי פתיחת קלטת הג’ל במכסה תא הקריטריון כדי לפצח את הקלטת ולשחרר את הג’ל. החל כמה מיליליטרים של מים למרכז מגש מדגם UV של הדמיה MP ChemiDoc. בזהירות להרים את הג’ל מהקלטת ומניחים אותו על המגש. הפעל את תוכנת Image Lab ולכוד את תמונת הג’ל נטולת הכתמים (איור 1A) עם ההגדרות הבאות:יישום: ג’ל ללא כתמיםזמן הפעלת ג’ל: דקה אחתאזור הדמיה: ג’ל קריטריוןזמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר מוציאים את הג’ל מהמגש לדוגמה וממשיכים מיד לשלב ההעברה. 4. העברת חלבון עם מערכת טורבו טרנס-כתם (~ 10 דקות) פתח חבילת העברה טרנס-כתם טורבו מידי PVDF; מניחים את הערימה התחתונה (הכוללת את הממברנה) על בסיס קלטת ההעברה. מניחים את הג’ל על גבי הממברנה, מניחים את הערימה העליונה על הג’ל, ומרדים בועות. הנח את המכסה על בסיס הקלטת וסובב את החוגה כדי לנעול אותה. הכנס את הקלטת לתא הגוש. התחל את ההעברה על-ידי בחירת תוכנית טורבו מוגדרת מראש ובחירת גודל ג’ל הקריטריון (midi) ולאחר מכן הקש RUN. ריצה טיפוסית אורכת רק 7 דקות. כאשר ההעברה נגמרת, לפרק את כריך סופג ומניחים הן את הכתם ואת הג’ל במיכל עם מים deionized. 5. ג’ל ללא כתמים והדמיית כתמים באמצעות מערכת MP Chemidoc לבדיקת יעילות ואיכות העברת חלבונים (~ 5 דקות) מניחים את הג’ל שלאחר ההעברה על מגש הדגימה של הדמיה ChemiDoc MP. הפעל את תוכנת Image Lab ולכוד את התמונה נטולת הכתמים של הג’ל שלאחר ההעברה (איור 1B) עם ההגדרות הבאות:יישום: ג’ל ללא כתמיםזמן הפעלת ג’ל: ללאאזור הדמיה: ג’ל קריטריוןזמן חשיפה לתמונה: זהה לזמן החשיפה לתמונת הג’ל שלפני ההזעה הסר את הג’ל מהמגש לדוגמה ולאחר מכן תמונה של הכתם (איור 1C) עם ההגדרות הבאות. שמור על הכתם רטוב עם כמה טיפות מים או TBST בעת הדמיה.יישום: כתם ללא כתמיםאזור הדמיה: ג’ל קריטריוןזמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר הסר את קרום סופג ממגש המדגם ומניחים אותו במיכל עם TBST (0.1% Tween 20 ב- TBS). 6. דגירת נוגדנים חסום על ידי הצבת הכתם בתמיסה של 3% אלבומין סרום שור (BSA) ב TBST בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה. דגירה הכתם לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתמיסה המכילה נוגדן ראשוני העכבר הרים נגד חלבון היעד הראשון נוגדן ראשי ארנב הרים נגד חלבון היעד השני. יוצקים את הפתרון המכיל את הנוגדן העיקרי. לאחר מכן, לשטוף את הכתם על ידי נסער ב 20 מ”ל של TBST במשך 5 דקות. חזור על 4x עבור סך של 5 שוטף. דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר בתמיסת הנוגדנים המשנית המכילה נוגדן עז נגד עכבר Dylight 650 מצומד ונוגדן עז נגד עכבר Dylight 549 מצומד עז נגד ארנב. יוצקים את הפתרון המכיל את הנוגדן העיקרי. לאחר מכן, לשטוף את הכתם על ידי נסער ב 20 מ”ל של TBST במשך 5 דקות. חזור על 4x עבור סך של 5 שוטף. 7. הדמיה וניתוח נתונים על ידי תוכנת מעבדת תמונה- נורמליזציה כוללת של חלבונים (~ 5 דקות) השג תמונה פלואורסצנטית מרובת ערכים של הכתם (איור 1E) על-ידי פתיחת פרוטוקול רב-ערוצי חדש, קביעת תצורה של שלושה ערוצי פלואורסצנט והפעלת הפרוטוקול.ערוץ 1:יישום: כתמים Dylight 650אזור הדמיה: ג’ל קריטריוןזמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותרערוץ 2:יישום: כתם דילייט 549אזור הדמיה: ג’ל קריטריוןזמן חשיפה לתמונה: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותרערוץ 3:יישום: כתם ללא כתמיםאזור הדמיה: זמן חשיפה לתמונת ג’ל קריטריון: ממוטב אוטומטית ללהקות האינטנסיביות ביותר לחץ על סמל נורמליזציה מתיבת כלי הניתוח ולחץ על כן כדי לזהות נתיבים ורצועות. בחר והשתמש ב”כלים של נתיבים ולהקות” כדי לבצע התאמות לנתיבים וללהקות במידת הצורך. בחרו תמונה נטולת כתמים כערוץ הנורמליזציה. בחר כלי ניתוח MW והקצה את הנתיבים הסטנדרטיים של MW על-ידי סימון התיבות שמתחתיהם. כדי להציג את אמצעי האחסון המנורמלים, לחץ על טבלת הניתוח בסרגל הכלים. כל החישובים יבוצעו באופן אוטומטי על-ידי התוכנה, כולל פקטור הנורמליזציה ואמצעי אחסון מנורמלים. ערכי עוצמת רצועת החלבון המשמשים כיעד מותאמים כעת לשינויים בעומס החלבון. זה יאפשר השוואות מדויקות של חלבוני היעד בין הדגימות.