Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos
Summary
En este trabajo se describe la formación de estructuras a base de péptidos altamente ordenadas por el proceso espontáneo de auto-ensamblaje. El método utiliza péptidos disponibles comercialmente y equipo de laboratorio común. Esta técnica se puede aplicar a una gran variedad de péptidos y puede conducir al descubrimiento de nuevos conjuntos basados en péptidos.
Abstract
En la naturaleza, las estructuras funcionales complejos se forman por el auto-ensamblaje de biomoléculas en condiciones suaves. La comprensión de las fuerzas que controlan auto-ensamblaje e imitando este proceso in vitro traerá consigo importantes avances en las áreas de ciencias de los materiales y la nanotecnología. Entre los bloques de construcción biológicos disponibles, los péptidos tienen varias ventajas ya que presentan una diversidad sustancial, su síntesis en gran escala es sencillo, y que pueden ser fácilmente modificados con entidades biológicas y químicas 1,2. Varias clases de péptidos diseñados tales como péptidos cíclicos, péptidos de anfífilo y-péptido conjugados de auto-ensamblarse en estructuras ordenadas en solución. Dipéptidos homoaromáticos, son una clase de péptidos auto-ensambladas cortos que contienen toda la información molecular necesaria para formar estructuras ordenadas tales como nanotubos, esferas y fibrillas de 3-8. Una gran variedad de estos péptidos está disponible comercialmente.
<pclass = "jove_content"> Este artículo presenta un procedimiento que conduce a la formación de estructuras ordenadas por el auto-ensamblaje de péptidos homoaromáticos. El protocolo requiere sólo reactivos comerciales y equipamiento básico de laboratorio. Además, el artículo describe algunos de los métodos disponibles para la caracterización de conjuntos basados en péptidos. Estos métodos incluyen de electrones y microscopía de fuerza atómica y de Fourier-Transform espectroscopia infrarroja (FT-IR). Por otra parte, el manuscrito demuestra la mezcla de péptidos (coassembly) y la formación de un "cuentas de un collar" estructura similar por este proceso. 9 Los protocolos presentados aquí pueden adaptarse a otras clases de péptidos o bloques de construcción biológica y pueden potencialmente conducir al descubrimiento de nuevas estructuras a base de péptidos y para un mejor control de su montaje.Introduction
Formas Naturaleza estructuras ordenadas y funcionales en el proceso de auto-ensamblaje biomolecular. La comprensión de las fuerzas que rigen este proceso espontáneo puede conducir a la capacidad de imitar auto-ensamblaje in vitro y en consecuencia a los grandes avances en el área de ciencias de los materiales 10,11. Los péptidos, específicamente, una gran promesa como un bloque de construcción biomolecular, ya que presentan gran diversidad estructural, facilidad de síntesis química, y pueden ser fácilmente funcionalizados con entidades biológicas y químicas. El campo de los péptidos auto-ensamblaje fue iniciado por Ghadiri y sus colegas, quienes demostraron el auto-ensamblaje de nanotubos peptídicos mediante péptidos cíclicos con ácidos y D-12 L-aminoácidos alterna. Otros enfoques exitosos para el diseño de ensamblajes de péptidos incluyen péptidos lineales bolaamphiphile 5, amphiphiles (AP) 6, péptidos iónicos autocomplementarias no conjugados 13, péptidos similares a tensioactivos <sup> 4,14, y dibloque copolypeptides 15.
Un enfoque más reciente es el de la auto-ensamblaje de péptidos cortos aromáticos, denominado dipéptidos homoaromáticos. Estos péptidos comprenden sólo dos aminoácidos con la naturaleza aromático (por ejemplo, Phe-Phe, dicarbonato de terc-butilo (Boc)-Phe-Phe) 7,8,16-21. Las estructuras formadas por estos péptidos homoaromáticos incluyen estructuras tubulares, esferas, conjuntos laminares y fibras 6,8,15,21-32. Las fibras en algunos casos generar una malla de fibrillas que se obtiene un hidrogel 33-37. Estos conjuntos han sido explotados para aplicaciones de biosensores, la administración de fármacos, la electrónica molecular, etc. 38-45
Este documento describe los pasos experimentales necesarios para poner en marcha el auto-ensamblaje espontáneo de péptidos homoaromáticos. Además, se presenta el proceso de péptido coassembly. Este proceso implica el auto-ensamblaje de más de un tipo de péptidomonómero.
Nuestra demostración incluye la coassembly de dos péptidos disponibles comercialmente: el péptido difenilalanina (NH 2-Phe-Phe-COOH) y su análogo protegido con Boc (Boc-Phe-Phe-OH). Cada uno de los péptidos auto-ensambla en una estructura supramolecular: los formularios de péptidos difenilalanina conjuntos tubulares y el péptido auto-ensambla Boc-Phe-Phe-OH en cualquiera de esferas o fibras dependiendo del disolvente 7,17,46. Mezclamos los dos péptidos en ciertas proporciones y caracterizaron los conjuntos resultantes mediante microscopía electrónica, microscopía de fuerza y la espectroscopia FT-IR. Los métodos demostraron la formación de una estructura basada en péptidos que se compone de elementos esféricos con un diámetro de varias micras (1-4 micras) que están conectados por conjuntos alargados con un diámetro de unos pocos cientos de nanómetros (~ 300-800 nm) . Los conjuntos de cadenas de cuentas parecen en su morfología, como las estructuras esféricas parecen ser roscado en laconjuntos alargados. Por ello denominamos estas asambleas "collares biomoleculares". Los "collares biomoleculares" pueden servir como un nuevo biomaterial, como un agente de administración de fármacos o como un andamio para aplicaciones electrónicas. Por otra parte, el procedimiento que conduce a la auto-ensamblaje de péptidos se puede utilizar con otras clases de péptidos y biomoléculas. Todo ello puede conducir a una mejor comprensión de las fuerzas que intervienen en el autoensamblaje y la formación de nuevas estructuras ordenadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En resumen, este trabajo demuestra la facilidad con la que conjuntos basados en péptidos se pueden formar in vitro. El proceso consiste en péptidos y disolventes disponibles comercialmente, y se produce espontáneamente en condiciones ambientales, después de la adición de un disolvente polar para el tubo de ensayo. Es crucial usar HFP como disolvente de los péptidos, debido a la baja solubilidad de los péptidos en otros disolventes orgánicos. Además, debido a la alta volatilidad de HFP es necesari…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Marie Curie Internacional Reintegración Grant y por la Fundación Alemana-Israel. Reconocemos el Sr. Yair Razvag para el análisis de AFM.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NH2-Phe-Phe-OH | Bachem | G-2925.0001 | |
| Boc-Phe-Phe-OH | Bachem | A-3205.0005 | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 52512-100ML | |
| Ethanol absolute (Dehydrated) AR sterile | Bio-Lab Ltd. | 52555 | Blending with TDW for the preparation of 50% solution |
| Uranyl acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | For negative staining. It is possible to work without it. |
| glass cover slip | Marienfeld Laboratory Glassware | 110590 | |
| TEM grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200-Cu-50 | Formvar/Carbon 200 Mesh, Cu |
| Quantitive filter paper | Whatman | 1001055 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882-100G | 99.9 atom % D |
| CaF2 window | PIKE Technologies | 160-1212 | 25 mm x 2 mm window. For FT-IR measurments |
| AFM tips | NanoScience Instruments | CFMR | Aspire probes, CFMR-25 series |
| Filter units | Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| SEM | FEI | Quanta 200 ESEM | |
| TEM | FEI | Tecnai T12 G2 Spirit | |
| AFM | JPK Instruments | A JPK NanoWizard3 | |
| FT-IR | Thermo Fisher Scientific | Nicolet 6700 advanced gold spectrometer | |
| FT-IR Purge | Parker | BALSTON FT-IR Purge Gas Generator model 75-52 | |
| OMNIC (Nicolet) software | Thermo Nicolet Corporation | For FT-IR spectra analysis | |
| Vortex mixer | Wisd Laboratory Equipment | ViseMix VM | |
| Weight | Mettler Toledo | NewClassic MS | |
| Sputter coater | Polaron | SC7640 Sputter Coater |
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