Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Amy H. Van Hove; Brandon D. Wilson; Danielle S. W. Benoit

doi:10.3791/50890

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Química

Functionalization بمساعدة الميكروويف بولي (جلايكول الإثيلين) وعلى الراتنج الببتيدات للاستخدام في سلسلة Polymerizations وتشكيل هيدروجيل

Published: October 29, 2013

doi:

10.3791/50890

Amy H. Van Hove¹, Brandon D. Wilson², Danielle S. W. Benoit^1,2,3

¹Department of Biomedical Engineering,University of Rochester, ²Department of Chemical Engineering,University of Rochester, ³Center for Musculoskeletal Research,University of Rochester Medical Center

Summary

وهذا الفيديو يوضح طريقة سريعة وفعالة لميتاكريليت بولي (جلايكول الإثيلين)، مما يتيح polymerizations سلسلة والتوليف هيدروجيل. فإنه سيتم شرح كيفية إدخال بالمثل ظائف methacrylamide في الببتيدات، بالتفصيل الأساليب التحليلية المشتركة لتقييم كفاءة functionalization، وتقديم الاقتراحات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها والتعديلات المتقدمة، وإظهار تقنيات توصيف هيدروجيل نموذجية.

Abstract

واحدة من الفوائد الرئيسية لاستخدام بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) macromers في تشكيل هيدروجيل هو براعة الاصطناعية. القدرة على الاستفادة من مجموعة كبيرة ومتنوعة من PEG الأوزان الجزيئية وتكوينات (رقم الذراع، وطول ذراع، والمتفرعة نمط) يتيح الباحثين رقابة مشددة على الهياكل الناتجة هيدروجيل والممتلكات، بما في ذلك معامل يونغ وحجم شبكة. وهذا الفيديو توضيح كفاءة، طريقة سريعة، الخالية من المذيبات بمساعدة الميكروويف لميتاكريليت السلائف PEG في بولي (جلايكول الإثيلين) dimethacrylate (PEGDM). يوفر هذا الأسلوب الاصطناعية المواد الأولية التي تشتد الحاجة إليها لتقديم الطلبات في تسليم المخدرات والطب التجديدي. الأسلوب هو موضح متفوقة على الطرق التقليدية methacrylation كما هو أسرع بكثير وأكثر بساطة، فضلا عن أكثر اقتصادا وصديقة للبيئة، وذلك باستخدام كميات صغيرة من الكواشف والمذيبات. وسوف نقوم أيضا إثبات وجود تكييف هذه التقنية لفي الراتنج methacrfunctionalization ylamide من الببتيدات. يسمح هذا الأسلوب على الراتنج وN-محطة من الببتيدات أن بين functionalized مع جماعات methacrylamide قبل deprotection والانقسام من الراتنج. وهذا يسمح لإضافة الانتقائي للمجموعات methacrylamide إلى N-تيرميني من الببتيدات بينما الأحماض الأمينية مع مجموعات التفاعل الجانب (على سبيل المثال أمين الرئيسي ليسين، والكحول الأولية من سيرين، والكحول الثانوية ثريونين، والفينول من التيروزين) تظل محمية، ومنع functionalization في مواقع متعددة. هذه المادة سوف بالتفصيل الأساليب التحليلية المشتركة (بروتون الرنين المغناطيسي النووي الطيفي ^(؛ H-NMR) ومصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين وقت الرحلة مطياف الكتلة (MALDI-TOF)) لتقييم كفاءة functionalizations. وسيتم تناول المخاطر المشتركة، واقترح طرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والتعديلات إرادة الأسلوب الذي يمكن استخدامه لمزيد من الوظائف لحن macromer والناتجة هيدروجيل الفيزيائية والكيميائيةالخصائص. سيظهر استخدام منتجات توليفها لتشكيل الهلاميات المائية لتسليم المخدرات ودراسات التفاعل بين الخلايا المواد، مع إيلاء اهتمام خاص لتعديل تكوين هيدروجيل أن تؤثر على حجم فتحات الشباك، والسيطرة على صلابة هيدروجيل والافراج عن المخدرات.

Introduction

بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) الهلاميات المائية هي الحيوية الشائعة المستخدمة في الطب التجديدي وتسليم المخدرات التطبيقات ^1-3. هذه الهلاميات المائية توفر مزايا هامة على المواد الحيوية الأخرى. الهلاميات المائية PEG هي الاصطناعية، وتقدم درجة عالية من السيطرة على الخواص الهندسية مثل معامل المرونة ومعدل تدهور مقارنة مع نظرائهم مادة بيولوجية الطبيعية ^1. كما أنها مشتقة صناعيا، PEG لديه أقل بكثير تقلب دفعة إلى دفعة مقابل المواد المشتقة طبيعيا ^4. بسبب التركيب الكيميائي للPEG، هذه الهلاميات المائية هي ماء عالية، ومقاومة للامتصاص البروتين، وحيويا ^3. هذه المقاومة لامتصاص البروتين يسمح الهلاميات المائية PEG ليكون بمثابة "لائحة بيضاء"، وتمكين الباحثين من استجواب ودراسة العوامل البيولوجية أو الكيميائية محددة (المخدرات، والجزيئات الحيوية، الببتيدات التصاق الخلية، الخ) وهذه الأدوار المحددة الواقعتلعب التمرير في السيطرة على الخلية و / أو سلوك الأنسجة.

انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 1: أمثلة من بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) أبنية A) B الخطي PEG) 4 ذراع PEG مع بينتاايروثريتول الأساسية C) 8 الذراع PEG مع جوهر hexaglycerol D) 8 الذراع PEG مع.. tripentaerythritol الأساسية. n هو عدد PEG يكرر على كل ذراع. كل تكرار لها وزنها الجزيئي من 44 جم / مول، وبالتالي يمكن حساب ن من الوزن الجزيئي الشاملة والهيكل / الذراع #.

هي السلائف PEG متوفرة مع مجموعة متنوعة من أبنية والأوزان الجزيئية (الشكل 1 ). متفاوتة في العمارة (الذراع #) ويكرر جلايكول الإثيلين (ن) من PEG يمكن استخدامها للسيطرة على خصائص الشبكات هيدروجيل تشكلت من هذه macromers. معدلة PEG يحتوي على مجموعات الهيدروكسيل المحطة التي يجب أن يتم استبداله مع وظائف بديلة لتسهيل يشابك التساهمية عبر polymerizations، واستراتيجية يشابك العاملين الأكثر شيوعا لالهلاميات المائية PEG، قبل تشكيل شبكات هيدروجيل. وهناك مجموعة متنوعة من الجماعات الكيميائية التي يمكن إدراجها في macromers PEG لتسهيل البلمرة ويشابك شبكة (اكريليت، ميتاكريليت، الأثير الفينيل، في norbornene، الخ). على الرغم من مجموعة متنوعة من الوظائف محطة لتسهيل يشابك، لا يوجد سوى اثنين الآليات التي يمكن أن تحدث البلمرة: خطوة وسلسلة النمو (أو خليط من الاثنين، وضع مختلط).

g2.jpg "العرض =" 600px ل"/>
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

النتائج البلمرة شبكة هيدروجيل النظرية التخطيطي A) التقليدية النتائج البلمرة سلسلة النمو في الشبكات غير المتجانسة التي تحتوي على بولي كثيفة (ميتاكريليت) المناطق وزيادة nonidealities الشبكة مثل الحلقات، والسلائف غير المتفاعل، والتشابكات دائمة يشابك B) خطوة النمو في: الرقم 2. هياكل الشبكة بشكل ملحوظ أكثر تجانسا (وليس لتوسيع نطاق).

الوظائف التي تشعبي عن طريق البلمرة سلسلة النمو لا تتطلب وجود crosslinker إضافية. ومع ذلك، الهلاميات المائية بلمرة سلسلة إنتاج هياكل غير المتجانسة التي تحتوي على شبكة كثيفة المناطق يشابك (الشكل 2A) ^1. في المقابل، خطوة نمو البلمرة ل requiالدقة في استخدام crosslinker أو زملاء مونومر الذي هو رد الفعل مع المجموعات الوظيفية محطة للmacromers PEG. كما المجموعات الوظيفية محطة على PEG يمكن أن تتفاعل فقط مع crosslinker وcrosslinker يمكن أن تتفاعل فقط مع المجموعات الوظيفية محطة على PEG، وهذا يؤدي إلى مزيد من تجانس بنية الشبكة (الشكل 2B) ^1. polymerizations خطوة النمو أيضا يؤدي عادة إلى تحويل أعلى من المجموعات الوظيفية، خفض كمية السلائف غير المتفاعل والمحتملة ل/ الاستجابات الالتهابية المناعية بسبب ذوبان، macromers الفردية ^1. كما تم تطوير أساليب البلمرة وضع مختلط التي تجمع بين كل من البلمرة خطوة وسلسلة النمو من خلال استخدام macromers التي يمكن أن تتفاعل كل من الذات (سلسلة النمو) وتتفاعل مع crosslinker (خطوة النمو). وهذا ينتج الهلاميات المائية مع خصائص كل آلية البلمرة، ويمكن استخدامها لإنتاج والهياكل شبكة متنوعة أكثر تعقيدا من أيخطوة أو شبكات سلسلة النمو وحده ^1.

في حين أن هناك عدد كبير من المجموعات الوظيفية التي يمكن استخدامها لfunctionalize PEG وتسهيل تشكيل هيدروجيل، الميثاكريليت وnorbornenes هي بعض من الأكثر شيوعا الأنصاف البلمرة سلسلة وخطوة النمو، على التوالي. كل من هذه الوظائف توفر السيطرة الزمانية المكانية ممتازة على البلمرة الشبكة، وعندما تستخدم لتغليف الخلايا، ودعم هذه الشبكات عالية البقاء على قيد الحياة عموما الخلية ^5-7. Dimethacrylate بين functionalized PEG (PEGDM) تشعبي عبر سلسلة البلمرة ويسمح لدمج الجزيئات الحيوية أو عوامل أخرى من خلال المشاركة في البلمرة مع اكريليت، ميتاكريليت الجزيئات الحيوية، أو بين functionalized بالمثل، ^5،6. الهلاميات المائية PEGDM لها مزايا هامة على أنظمة البلمرة سلسلة النمو بديلة مثل اكريليت بين functionalized PEG (PEGDA). باستخدام الطرق التقليدية، PEGDA يمكن توليفها بشكل أسرع من PEGDM؛ حويفر، وذلك باستخدام التوليف بمساعدة الميكروويف، PEGDM التوليف هو أكثر كفاءة. وغالبا ما توليفها PEGDA في ليلة وضحاها ⁸ أو 24 ساعة ⁹ ردود الفعل، ولكن يمكن أيضا تصنيعه في أربع ساعات في درجات حرارة مرتفعة ^10. كما يتم تصنيعه PEGDM تقليديا عن طريق تفاعل بين عشية وضحاها أو ¹¹ لمدة 24 ساعة ^5، مع بعض أساليب تمديد فترة رد الفعل إلى 4 أيام ^12. باستخدام طريقة بمساعدة الميكروويف أثبتت هنا، PEGDM يمكن أن تنتج في رد فعل 5 دقائق. بينما PEGDM ديه حركية التفاعل أبطأ من PEGDA ^13، رد فعل يشابك لPEGDM لا يزال السريع، والتي تحدث في غضون دقائق، ويحقق قدرا أكبر من تحويل macromer من PEGDA باسم للا مائية متزايدة من مجموعة ميتاكريليت يزيد تجميع مجموعة وظيفية في الحل، مما يزيد من احتمال نقل وتحويل جذري ميتاكريليت ^14. وترتبط الهلاميات المائية PEGDM أيضا مع زيادة الجدوى الخلوية والنمو كمابالمقارنة مع الهلاميات المائية PEGDA، على الأرجح بسبب الانخفاضات في معدل التفاعل في أي وقت من الأوقات، مما يقلل من تركيز جذرية وغير المتفاعل macromers الحاضر ^14. polymerizations-ثيول إيني مثل تلك التي تستخدم في norbornene PEG-بين functionalized (PEGN) الهلاميات المائية عن طريق البلمرة شكل خطوة النمو، وتتطلب استخدام PEGN وcrosslinker التي تحتوي في المتوسط أكبر من مجموعتين وظيفية. منذ thiyl الجذور تتفاعل مع السندات في norbornene بين الكربون مزدوج، وتستخدم متعددة ثيول التي تحتوي على crosslinkers عادة تشعبي الهلاميات المائية PEGN، مما يسمح لإدراجها السهل من الببتيدات مع الأحماض الأمينية السيستين وظائف ^7. في حين أن هناك العديد من كيمياء الأخرى التي تتفاعل عبر البلمرة خطوة النمو (ردود فعل مايكل المضافة مثل ^ثيول-15 أكريلات وثيول الفينيل سولفان ¹⁶ "، انقر على" ردود الفعل مثل آلكاين أزيد ¹⁷ الخ)، الهلاميات المائية ثيول في norbornene هي شائعة جدا، وسلالة منالحلبة في norbornene إلى زيادة كبيرة في معدل التفاعل ويقلل من فرصة للفي norbornene مزدوجة سلسلة البلمرة يمر السندات ^7.

ويستند القرار بين ميتاكريليت، في norbornene، أو functionalization بديلة لتسهيل تشكيل هيدروجيل إلى حد كبير على هذا النهج. على سبيل المثال، أثبتت سلسلة نمو شبكات بلمرة PEGDM كذلك مناسبة للسيطرة على توطين خلية في تطوير الأنسجة المهندسة السمحاق ^18،19. خطوة النمو بلمرة شبكات الربط هي أكثر ملاءمة لإدراج تسلسل الببتيد لتسهيل تدهور هيدروجيل إنزيمي متجاوبة، نظرا لسهولة دمج انزيم تسلسل الركيزة باستخدام ثيول (السيستين) التي تحتوي على الببتيدات وmacromers في norbornene بين functionalized ^20. إذا كان السؤال البحثي سيتم تناولها على أفضل وجه عن طريق استخدام الهلاميات المائية خطوة النمو، فيربانكس وآخرون. يقدم وصفا مفصلا للnorborاستراتيجية functionalization نيني لPEG ^7. الإرادة ورقة هذا التفصيل كيف PEG وتسلسل الببتيد يمكن بين functionalized (مع ميتاكريليت لPEG، وmethacrylamide لالببتيدات) لسلسلة من ردود الفعل البلمرة.

تقليديا، يتم إنتاج PEGDM عن طريق تفاعل PEG مع كلوريد methacryloyl والترايثلامين في ثنائي كلورو ميثان. ولا يسمح للرد فعل للتقدم في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها أو ¹¹ لمدة 24 ساعة ^5، مع بعض أساليب تمديد فترة رد الفعل إلى 4 أيام ¹² قبل الترشيح، وهطول الأمطار في ايثر، وجمع. بينما توجد العديد من الاختلافات من هذا النهج، وكلها تستغرق وقتا طويلا، تتطلب مجموعة كبيرة من معدات التركيب الكيميائي، وهي ليست صديقة للبيئة، لأنها تنطوي على استخدام كميات كبيرة نسبيا من الكواشف عالية النقاء والمذيبات. للتحايل على هذه القيود، لين جيبسون وآخرون. وضعت لذلك، طريقة بمساعدة الميكروويف الخالية من المذيبات لfunctionalize PEG مع الشركة المصرية للاتصالات مجموعات ميتاكريليت rminal (الشكل 3A) ^12. في هذا التفاعل، ومجموعات الكحول محطة للPEG تتفاعل مع واحدة من ذرات الكربونيل من أنهيدريد ميثاكريليك لتشكيل الكربوكسيل. هذا يولد المنتج PEGDM، مع حمض ميثاكريليك كمنتج جانبي. هذا التوليف لديه العديد من المزايا المميزة لتجميع الموجات الدقيقة، بما في ذلك تخفيض وقت رد الفعل وأساليب التوليف الخالية من المذيبات ^21. توليف الميكروويف هو أفضل من الأساليب التي تمت مناقشتها سابقا كما هو أسرع بكثير، تتطلب معدات أقل اتساعا التوليف (مثل الأواني الزجاجية، لوحات رد فعل)، ويستخدم أقل الكاشف الشاملة وكميات المذيبات كما هو مطلوب فقط لتنقية المذيبات المنتج / جمع وليس لل التوليف، مما يجعلها أكثر اقتصادا وصديقة للبيئة.

0PX "/>
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

وكان رد فعل الخطط Functionalization A) بولي (جلايكول الإثيلين) مع 10x المولي أنهيدريد ميثاكريليك الزائدة لإنتاج بولي (جلايكول الإثيلين) ميتاكريليت B) وهذه الطريقة يمكن استخدام نفس لfunctionalize وN-محطة من متواليات الببتيد، وتشكيل: الرقم 3. methacrylamide الببتيد بين functionalized. قبل تنفيذ هذا الإجراء قبل الشق الببتيد من الراتنج، functionalization الانتقائي للN-محطة لا يمكن أن يؤديها كما لا تزال مجموعات الجانب الأحماض الأمينية المحمية. ن: عدد PEG يكرر في macromer (ن = 45.5، 227 و 455، على التوالي، ل2، 10، 20 كيلو دالتون وتستخدم الخطية PEG). R1 إلى RN: الأمينية السلاسل الجانبية حامض. PG1 لPGN: سلسلة جانبية حماية المجموعات. TFA: حمض trifluoroacetic. نصائح: triisopropylsilane. DODT: 3،6-dioxa-1 ،8-octanedithiol. H ₂ O: الماء.

وقد الأسلوب methacrylation بمساعدة الميكروويف تكييفها مؤخرا من قبل مجموعتنا لfunctionalize وN-محطة من الببتيدات مع مجموعات methacrylamide (الشكل 3B) لتسهيل الببتيد إدماجها في مجموعة متنوعة من البوليمرات وشبكات البوليمرية. في هذا التفاعل، وأمين الرئيسي للN-محطة من الببتيد يتفاعل مع ذرة الكربونيل على أنهيدريد ميثاكريليك لتشكيل أميد. هذا يولد methacrylamide الببتيد بين functionalized، مع حمض ميثاكريليك المنتجة كمنتج جانبي. عند استخدام هذا الإجراء لfunctionalize وN-محطة من متواليات الببتيد، فمن المهم أن الأحماض الأمينية التي تحتوي على سلاسل الجانب التفاعلي (الأمينات الأولية (يسين)، والكحول (سيرين، ثريونين)، والفينول (التيروزين)) محمية أثناء functionalization، و والمشقوق فقط جماعات حماية بعد التأسيس methacrylamide.

هذه المادة سوف تظهر كل من هذه أفران الميكرأساليب افي بمساعدة لتجميع PEGDM وfunctionalize متواليات الببتيد على الراتنج، وتسليط الضوء على المخاطر المشتركة واقتراح طرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها. في هذه المقالة، سوف تكون مفصلة أساليب لأداء التقنيات الكيميائية التحليلية المستخدمة عادة لتقييم functionalization المنتج، وسوف تعطى الاقتراحات والموارد لتنفيذ التعديلات أكثر تقدما. سيظهر النتائج النموذجية، والتي تشمل استخدام PEGDM توليفها لتشكيل شبكات هيدروجيل، استغلال الهلاميات المائية شكلت للسيطرة على الافراج عن المخدرات النموذج، وتوظيف الببتيدات بين functionalized لتسهيل التفاعلات خلية هيدروجيل. وسيولى اهتمام خاص لتميز هيدروجيل حجم شبكة ومناقشة كيف يمكن ضبطها تكوين هيدروجيل أن تؤثر هذه الممتلكات المادية الكامنة، التي تسيطر بدورها خصائص المواد السائبة مثل تصلب و ملفه الشخصي الافراج عن المخدرات.

Protocol

1. التجميعي بمساعدة الميكروويف من PEGDM لمنع التلوث مع الماء، وقبل كل الأواني الزجاجية الجافة المستخدمة في فرن (> 60 º C) لمدة 1 ساعة. ملاحظة: الأواني الزجاجية المطلوبة تتضمن: اثنين أكواب 100 مل، دورق 250 مل، 3 ملاعق، وبوخنر قارورة 250 مل، 7 سم، وبوخنر قمع، 10 سم، ساعة الزجاج. قبل البرد 100-150 مل ايثر اللامائية (74.12 جم / مول) لهطول يؤديها في وقت لاحق في خطوة 1.6 بصب ذلك في كوب، وتغطي الدورق مع كوب ووتش، ووضع الكأس في طبق التبلور مليئة الجليد. الانتقال الميكروويف وvortexer في غطاء الدخان الكيميائية. ملاحظة: يمكن أيضا prechilled ثنائي اثيل ايثر عن طريق وضع الدورق في الفريزر الكيميائية. فإن انخفاض درجة الحرارة ايثر بواسطة تقشعر لها الأبدان في الثلاجة حققت زيادة معدل هطول الأمطار وكفاءة. في وزن قارب صغير، تزن من 5 غرام من بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) من الجزيئيةالوزن لار من اختيارك (1،000-100،000 دا). إذا كان موجودا، وإزالة قطعة من البلاستيك من غطاء القارورة التلألؤ. القارورة الفارغة، والاستغناء عن 10 المولي الزائدة من أنهيدريد ميثاكريليك في القارورة (MA، 154.16 جم / مول) في المعادلة 1 في غطاء محرك السيارة. إضافة PEG إلى قارورة التلألؤ. (1) حيث هو كتلة من PEG في ز، هو الوزن الجزيئي للPEG في ز / مول، هو عدد مجموعات OH محطة على PEG، و هو الجزيئيةالوزن لار من MA في ز / مول. فضفاضة تحريف قبعة على قارورة التلألؤ. تعيين الميكروويف لمدة 5 دقائق على أقصى قدر من السلطة. ارتداء القفازات المقاومة للحرارة، وإزالة قارورة من فرن الميكروويف كل 30 ثانية. تشديد بالكامل الغطاء ودوامة لمدة 30 ثانية. كرر حتى تم المايكرويف الحل الكامل لمدة 5 دقائق. قد تحتاج غطاء لتحل محلها أثناء الإجراء بسبب تكسير. مع غطاء خففت، والسماح للPEGDM بارد لدرجة حرارة الغرفة. حل PEGDM في كمية صغيرة (10-15 مل) من ثنائي كلورو ميثان (DCM، 84.93 غرام / مول). ملاحظة: من المستحسن أن يسمح للPEGDM لتبرد بشكل ملحوظ (~ 5 دقائق) قبل DCM بالإضافة إلى ذلك، لمنع غليان DCM (مادة مسرطنة مشتبه فيها) بسبب الحرارة المتبقية. وPEGDM يمكن كسرها إلى قطع صغيرة باستخدام ملعقة وvortexed للمساعدة في حل. ترسيب PEGDM في 10X الزائدة ايثر الجليد الباردة لمدة 20 دقيقة. ملاحظة: قد يكون من الضروري الشوريراتش Ratch الجانب كوب مع ملعقة لبدء تشكيل الكريستال لترسيب أقل أوتاد الوزن الجزيئي (2،500 دا)، ومع ذلك، سوف PEG ذات وزن جزيئي أقل من 1،000 دا لا يعجل على الرغم من الخدش. باستخدام قمع بوخنر وقارورة، وجمع PEGDM عن طريق الترشيح فراغ. لا تحديد لاستكمال جفاف، حيث سيؤدي ذلك إلى تعزيز امتصاص الماء إلى PEGDM. ملاحظة: إذا لزم الأمر لنظام فراغ محددة في الاستخدام، فخ الفراغ يمكن وضعها بين الإعداد الترشيح ومصدر فراغ لحماية مضخة فراغ من الضرر الناجم عن أبخرة المذيبات. نقل PEGDM تصفيتها إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع إبرة قياس كبير مثقوب من خلال الغطاء للتهوية. بين عشية وضحاها تخزين في فراغ الغرفة لتجف. تنحل PEGDM في DCM وreprecipitate (كما في الخطوات 1،5-1،7) كخطوة نهائية لإزالة MA غير المتفاعل. تجف مرة أخرى كما في الخطوة 1.8. 2. توصيف PEGDM Functionalization استخدام الكلوروفورم بالديوتيريوم (120.38 جم / مول) مثل المذيبات، وإعداد العينات لل1 H-NMR. وضع عينة صغيرة من PEGDM (≈ 10 ملغ) في قارورة التلألؤ مع كمية صغيرة من المذيب (≈ 1.0 مل). تركيز الهدف هو 10 ملغ / مل. مرة واحدة تم حل العينة، ونقل إلى أنبوب NMR نظيفة. العينة يجب ملء 4-5 سم أسفل أنبوب NMR. جمع أطياف الرنين المغناطيسي النووي بروتون. ويتم جمع البيانات لدينا باستخدام مطياف 400 ميغاهيرتز. تشغيل العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 64 على الأقل بمسح للحصول على قرار بيانات كافية. إذا تحليل NMR (الشكل 4) يشير PEGDM functionalization هو أقل من 90٪، وينبغي تكرار الإجراء methacrylation. ضبط كميات كبيرة من MA المستخدمة لحساب المبلغ المخفض من unfunctionalized PEG. ملاحظة: يمكن حساب في المئة من الربط بين functionalized في PEGDM من لاحظ: نسبة النظرية لمحطة methacrالبروتونات ylate (أ، ب، ج) لالبروتونات PEG المركزية (د) (الشكل 4). لPEG الخطية، ويتم احتساب عدد البروتونات النظرية PEG المركزية المعادلة 2: (2) حيث هو الوزن الجزيئي للPEG في ز / مول و هو الوزن الجزيئي للتكرار PEG واحدة (44 جم / مول). لاخطي PEG، يجب أن يتم تعديل هذه المعادلة لتعكس بنية المتفرعة محددة (الشكل 1). ومن ثم يمكن حساب functionalization في المئة باستخدام المعادلة 3: (3) حيث <img alt="المعادلة 3.1" fo:content-width="30px" sالصليب الأحمر = "/ files/ftp_upload/50890/50890eq3.1.jpg" العرض = "40px" /> هي المنطقة المرصودة الذروة د (δ = 6.63 جزء في المليون)، هي مساحة لوحظ تحت قمم ميتاكريليت بروتون (أ، δ = 1.94 جزء في المليون؛ ب و ج، δ = 5.57 و6.12 جزء في المليون)، و هو عدد البروتونات النظرية ميتاكريليت (أ = 3 * ، ب = 1 * وج = 1 * – 6، 2 و 2 على التوالي لPEG الخطي). يجب أن يتم تنفيذ العملية الحسابية functionalization في المئة باستخدام القمم أ، ب، ج على حدة، ثم الأغذية متوسطإد للحصول على functionalization الشاملة في المئة. ملاحظة: يمكن بعد ذلك مدال PEGDM بين functionalized بما فيه الكفاية (في الماء، ضد الماء) والتي تم جمعها من قبل تجفيد لإزالة أنهيدريد ميثاكريليك المتبقية وحمض ميثاكريليك. ينبغي أن تكون مختلطة المنتج النهائي مع كمية صغيرة (0.01٪ بالوزن) من مثبطات مثل حمض الستريك أو فيتامين C وتخزينها مع المجففة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. ويمكن استخدام المنتج النهائي لإنتاج PEGDM الهلاميات المائية، كما هو مفصل في المادة إن الرب بواسطة خيطان وBurdick و22. 3. Functionalization بمساعدة الميكروويف من الببتيدات في الراتنج ملاحظة: يتم تصنيعه باستخدام الببتيدات لدينا Fmoc-الغليسين وانغ الراتنج، وذلك باستخدام مركب الببتيد الآلي مع رصد الأشعة فوق البنفسجية، وحلول 0.2 M حمض أميني في N-methylpyrrolidone (NMP، 99.1 جم / مول). ويستخدم 5٪ بيبرازين (86.1 جم / مول) في ثنائي ميثيل (DMF، 73.1 جم / مول) لdeprotection، 0.5 M O-Benzotriazole-N، N، N '، N'-ميثيل-uronium-hexafl يستخدم uoro فوسفات (HBTU، 379.3 غرام / مول) في DMF كما المنشط، ويستخدم 2 M diisopropylethylamine (DIEA، 129.3 غرام / مول) في NMP كقاعدة المنشط. كما يمكن الحصول على الببتيدات من مورد الببتيد التجارية. عند استخدام مصادر تجارية فمن الأهمية بمكان أن الببتيدات يتم شراؤها على الراتنج مع الجانب سلسلة الأحماض الأمينية حماية الفئات سليمة بدلا من المشقوق بالكامل، كما هو المعيار. ملاحظة: من المهم أن أي الأحماض الأمينية مع سلاسل الجانب التفاعلي محمية لضمان أن functionalization methacrylamide يحدث فقط في الأمينات الأولية للN-محطة من التسلسل. انظر الجدول رقم 1 للأحماض الأمينية مع الجماعات الجانب التفاعلي، وجماعات حماية نموذجية. يتم دمج الأحماض الأمينية مع جماعات حماية في تسلسل خلال التوليف الببتيد في نفس الطريقة كما الأحماض الأمينية nonprotected، وكثيرا ما تكون متاحة من نفس الموردين الأحماض الأمينية. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502"> حمض أميني مجموعة رد الفعل مجموعة حماية يسين أمين الابتدائي ثالثي butyloxycarbonyl (مجلس المفوضين) سيرين الكحول الأولية ثالثي بوتيل (TBU) ثريونين الكحول الثانوي TBU التيروزين الفينول TBU الجدول 1: الأحماض الأمينية رد الفعل وجماعات حماية نموذجية. توليف الببتيدات باستخدام معيار الببتيد التوليف المرحلة الصلبة، وتخزينها على الراتنج في 4 درجات مئوية في DMF حتى جاهزة للاستخدام. باستخدام قمع بوخنر 7 سم مع ورقة مرشح و 250 مل قارورة، وجمع الراتنج الببتيد من DMF عبر الترشيح. إذا كان موجودا إزالة قطعة من البلاستيك من غطاء القارورة التلألؤ. نقل الراتنج إلى قارورة التلألؤ. باستخدام ماصة المتاح، إضافة MA فقط ما يكفي لتغطية الراتنج في قارورة التلألؤ. وضع غطاء فضفاض على قارورة التلألؤ. تعيين الميكروويف لمدة 3 دقائق على أقصى قدر من السلطة. ارتداء قفازات مقاومة للحرارة، وإزالة قارورة من فرن الميكروويف كل 15-20 ثانية. تشديد بالكامل الغطاء ودوامة لمدة 15 ثانية. كرر حتى تم المايكرويف الحل لفوليرة لبنانية 3 دقائق. مع غطاء خففت، والسماح للحل الببتيد بارد لدرجة حرارة الغرفة. باستخدام كمية صغيرة من DMF وقمع بوخنر مع ورق الترشيح وقارورة، وجمع الراتنج الببتيد من القارورة. نقل الراتنج الببتيد إلى قارورة التلألؤ الطازجة ويلتصق وdeprotect الببتيد. في 0.25 مليمول من الراتنج، ونحن نستخدم 2 ساعة درجة حرارة الغرفة تفاعل مع التناوب، وذلك باستخدام مزيج من الانقسام 18.5 مل حمض trifluoroacetic (TFA، 114.02 جم / مول) مع 0.5 مل من كل triisopropylsilane (TIPS، 158.36 جم / مول)، 3،6-Dioxa-1 ،8-octanedithiol (DODT، 182.30 جم / مول) والماء منزوع الأيونات (18.02 جم / مول). ملاحظة: هذا الكوكتيل كافية بالنسبة لمعظم الببتيدات، ولكن لن deprotect 2،2،4،6،7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-السلفونيل الأحماض الأمينية (PBF) محمية (تستخدم عادة لحماية السلاسل الجانبية أرجينين). إذا كان التسلسل يحتوي على أي مجموعة PBF المحمية، ينبغي الاستعاضة 0.5 مل من TFA مع 0.5 مل thioanisole (124.زيادة 20 جم / مول) والانقسام الوقت ل4 ساعة. ملاحظة: إذا كان غائم، وأشكال مادة بلورية في كوكتيل الانقسام، والببتيد من المرجح تحطمها من الحل وحجم كوكتيل الانقسام يجب أن تضاعف. هدئ 400 مل ايثر اللامائية على الجليد في كوب مغطاة الزجاج ووتش. ترسيب الببتيد في 10X ايثر الزائدة، وتقسيم بالتساوي بين حل أربعة أنابيب 50 مل المخروطية. أجهزة الطرد المركزي في 3،200 x ج لمدة 10 دقيقة لجمع الببتيد. صب قبالة الأثير، و resuspend الببتيد في 100 مل ايثر جديدة مقسمة بين اثنين من أنابيب 50 م المخروطية. تكرار عملية الطرد المركزي، إعادة التعليق في 50 مل من الأثير الطازجة مرتين ليصبح المجموع 4 يغسل الأثير. ملاحظة: هذا يزيل المواد الكيميائية المستخدمة في الكوكتيل الانقسام والمشقوق حماية المجموعات من الببتيد الصلبة. بعد الخطوة الطرد المركزي الماضي، صب آخرون النفاياتلها وتجفيف الببتيد بين عشية وضحاها في ظل فراغ. 4. توصيف الببتيد Functionalization استخدام 50:50 H 2 O: اسيتونتريل (41.05 جم / مول) + 0.1٪ TFA مثل المذيبات لتحليل MALDI-TOF العينات الببتيد. وضع عينة صغيرة (1 – 2 ملغ) من الببتيد في أنبوب 1.5 مل إيبندورف وتذوب العينة في 1 مل من MALDI المذيبات. إعداد مصفوفة الحل. حمض هو مصفوفة استخداما α-سيانو-4-hydroxycinnamic (CHCA، 189.2 غرام / مول) مثل المصفوفة. حل 10 ملغ / مل في مصفوفة MALDI المذيبات، وتشكيل محلول المخزون المصفوفة. ملاحظة: يمكن تخزين محلول المخزون المصفوفة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد لتحليلات إضافية. الجمع بين الببتيد وحل المصفوفة في نسبة 1:1. بقعة هذا الحل المشترك على ثلاثة مواقع منفصلة على لوحة عينة MALDI، إضافة 1 ميكرولتر / بقعة. تجفيف البقع، إما عن طريق التجفيف بالهواء أو باستخدام بندقية الحرارة. Respot وجافة كلالعينة. ملاحظة: Respotting تنتج عينة الببتيد / مصفوفة أكثر اتساقا، ويساعد في الحصول على إشارة واضحة. وينبغي أيضا أن تكون مجتمعة مزيج الببتيد القياسية مع حل المصفوفة في نسبة 1:1 ورصدت (مرة واحدة فقط) على لوحة MALDI. جمع البيانات MALDI-TOF. ويرجع ذلك إلى إضافة مجموعة methacrylamide إلى N-محطة من الببتيد، وينبغي أن تكون هناك زيادة 68 غ / مول في الوزن الجزيئي أعلاه أن من الببتيد الجزيئية الوزن وحده. ملاحظة: على عكس التوليف PEGDM، الببتيدات لا يمكن refunctionalized، وعلى الانقسام تتم إزالة مجموعات حماية على الأحماض الأمينية مع السلاسل الجانبية على رد الفعل، ويمكن لم يعد من الممكن ضمان functionalization الانتقائي للN-تيرميني. إذا كان تحليل MALDI (الشكل 5) يشير وبين functionalized الببتيد بشكل صحيح وجميع المجموعات حماية المشقوق مناسب، يمكن مدال الببتيد (في الماء، ضد الماء) والتي تم جمعها من قبل تجفيد ازالتها(المشقوق الانقسام الكوكتيل، الأثير، وحماية الجماعات الخ) ه الملوثات المتبقية. ينبغي نقل الببتيد الصلبة إلى أنبوب إيبندورف صغيرة وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

Representative Results

بروتون الرنين المغناطيسي النووي هي واحدة من التقنيات التحليلية الأكثر شيوعا لتقييم كفاءة التفاعل الكيميائي، ومنطقة تحت كل أطياف الذروة متناسبة مع المستويات النسبية للأن البروتون في العينة، مما يتيح تحديد نسب منتج ومتفاعل في العينة. لهذا التفاعل، 1 H-NMR تحليل (الشكل 4) يمكن استخدامها لحساب functionalization٪ من لاحظ: نسبة النظرية البروتونات ميتاكريليت محطة (أ، ب، ج) لالبروتونات PEG المركزية (د). كان PEGDM هو مبين في الشكل 4 2،000 دا قبل functionalization، وبالتالي ن = 2،000 دا / (44 دا / PEG تكرار) = 45.5، لذلك د = 4 * (ن 1) = 178، مما يجعل بروتون: نسبة وحدة NMR 178 / 102.16 = 1.74. في هذه الحالة، لتبلغ ذروتها لا يمكن أن تستخدم في تقييم functionalization٪، كما وجود الماء في العينة يزيد بشكل مصطنع المنطقة تحت الذروة. باستخدام الذروة ب، وfunctionalization٪ هو 1.00 * 1.74 / 2 * 100٪ = 87.1٪؛ النقيبز ج الذروة، وfunctionalization٪ هو 1.08 * 1.74 / 2 * 100٪ = 94.1٪. لذلك، و٪ functionalization العام هو 91٪ وبين functionalized هذا PEGDM بشكل كاف للاستخدام في التوليف هيدروجيل. عادة، يتم تحقيق حوالي 90٪ functionalization بعد جولة واحدة من methacrylation. ويرجع ذلك إلى العديد من القمم البروتون التي تنشأ في تحليل 1 H-NMR من الببتيدات، يتم التحقيق الببتيد functionalization بسهولة أكبر باستخدام MALDI-TOF مطياف الكتلة. ويتجلى هذا في الشكل 5، حيث تم تصنيعه في GKRGDSG الببتيد وتعرض لmethacrylamide functionalization. والمشقوق وجزء صغير من الببتيد لprefunctionalization تقييم الوزن الجزيئي (الشكل 5A)، والتي أظهرت وحظ الجزيئية التي تحدث في ذروة الوزن 676 جم / مول، والوزن الجزيئي المتوقع من الببتيد، مشيرا إلى التوليف الصحيح من تسلسل الببتيد. خضع ما تبقى من الببتيد وظيفية methacrylamideسعودة قبل الانقسام. كما يحتوي هذا الببتيد PBF المحمية الأحماض الأمينية R، تم تنفيذ الشق في كوكتيل يحتوي thioanisole لمدة 4 ساعة. بعد methacrylamide functionalization، يحدث وحظ الجزيئية الذروة في الوزن 744 جم / مول (الشكل 5B)، والوزن المتوقعة للmethacrylamide بين functionalized الببتيد (676 +68 ز / مول) وليس على الوزن الجزيئي المتوقع من الببتيد unfunctionalized، مشيرا الصحيح functionalization. لإظهار وظيفة كل من PEG وmethacrylamide بين functionalized الببتيد، أنتجت الهلاميات المائية PEGDM مع وبدون 0.5 ملي methacrylamide بين functionalized GKRGDSG (الشكل 6). أنتجت الهلاميات المائية مع 10٪ بالوزن خطي 10 كيلو دالتون PEGDM في برنامج تلفزيوني، مع 0.05٪ بالوزن ليثيوم فينيل-2 ،4،6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) كما photoinitiator. تم حقن الحل السلائف هيدروجيل بين اثنين من الشرائح الزجاجية مفصولة فاصل شريحة زجاجية وعقدت جنبا إلى جنب مع مقاطع الموثق. ثم يتعرض الحل السلائف إلى 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية في 2 ميغاواط / سم 2 لمدة 10 دقيقة للحث على يشابك، وبعد ذلك تم جمع المواد الهلامية 8 مم باستخدام لكمة أسطواني. تم تشطف المواد الهلامية في برنامج تلفزيوني، وسمح لتنتفخ لمدة 2 أيام لضمان تحققت شروط تورم التوازن 16،20. وقد نمت اللجان الدائمة الإنسان (مرور 3) إلى 80٪ confluency والمصنفة على الهلاميات المائية في 15،000 خلية / سم 2. سمح للخلايا الالتزام لمدة 48 ساعة قبل نقله إلى وسائل الإعلام الجديدة تحتوي على 0.5 ميكرولتر / مل calcein AM و 2 ميكرولتر / مل إيثيديوم homodimer (لايف / الميت عدة الجدوى من إينفيتروجن) وتصويرها في إطار المرحلة التباين ومضان في 10X التكبير باستخدام نيكون الكسوف تي 2000. وكانت اللجان الدائمة غير قادر على التمسك الهلاميات المائية PEG unfunctionalized (الشكل 6A)، ولكن عند إدراج خلية التصاق الببتيد RGD أنهم كانوا قادرين على الالتزام وتنتشر على سطح هيدروجيل (الشكل 6B). في / DEAD الصور الحقيقيةعرض لا تمثل الجدوى من السكان MSC المصنف، كما هي الخلايا اللجان الدائمة التي تعتمد على الالتصاق أن فصل من سطح هلام بعد وفاة وستتم إزالة أثناء عملية نقل وسائل الإعلام، مما أدى إلى تضخم مصطنع للبقاء الخلية المصنف. بدلا من ذلك، والمقصود الصور الفلورسنت لترسيم بين الخلايا الملتصقة والاختلافات الصغيرة في طوبولوجيا هيدروجيل، والتي يمكن أن يكون صعبا في إطار المرحلة المقابل وحدها. ومن المثير للاهتمام، المصنفة الخلايا nonspread على المواد الهلامية PEG-فقط وصمة عار إيجابية لكلا calcein AM وإيثيديوم homodimer، مشيرا إلى أن الخلايا كانوا يموتون في وقت التصوير. واحدة من العديد من المزايا لالهلاميات المائية PEG هو طبيعتها الانضباطي للغاية. تعديل التركيبة المحددة للهيدروجيل PEG يتيح الباحثون وجود درجة عالية من السيطرة على خصائص مثل معامل المرونة. كما هو موضح في الشكل 7، سواء PEG الوزن الجزيئي (الشكل 7A) ونسبة الوزن ( <stronز> الشكل 7B) معروفة للسيطرة على حجم هيدروجيل شبكة (ξ) والناتجة هيدروجيل صلابة ومعدل المخدرات مغلفة يفرج عنه. وقد تجلى هذا من خلال إنتاج الهلاميات المائية مع اختلاف الجزيئية PEGDM الوزن، والتحقيق في معامل هيدروجيل الناتجة وحجم شبكة (الشكل 8). أنتجت كل الهلاميات المائية مع PEGDM خطي 10٪ بالوزن في برنامج تلفزيوني، مع 0.05٪ بالوزن LAP كما photoinitiator. وكان 40 ميكرولتر من حل هيدروجيل السلائف في 1 مل المحاقن مع نصائح تقطع، وتتعرض لضوء 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية في 2 ميغاواط / سم 2 لمدة 10 دقيقة لتشكيل الهلاميات المائية، وإنتاج هندستها أسطواني ما يقرب من 5 ملم وقطرها 2 ملم في الطول . سمح المواد الهلامية إلى تضخم في برنامج تلفزيوني لمدة 2 قبل أيام من اختبار الميكانيكية. تم تحديد معامل هيدروجيل باستخدام MTS QT / 5 مع خلية الحمل 5 N حين ضغط بين 5 و 10٪ من ارتفاع هيدروجيل الأولي بمعدل 0.1 ملم / ثانية. بعد الانتهاء اختبار الميكانيكية، تم تحديد حجم شبكة عن طريق قياس هيدروجيل ماسو قبل (M) و بعد (M D) 24 ساعة من تجفيد عبر المعادلة فلورى-Rehner على النحو المفصل في القسم المناقشة، مع الحسابات التي أجريت في MATLAB. كما افترض، وزيادة الوزن الجزيئي للPEG macromer تسبب زيادة في حجم هيدروجيل شبكة (الشكل 8A) وانخفاض في هيدروجيل صلابة (الشكل 8B). ويمكن أيضا أن تسيطر هيدروجيل حجم شبكة وهلام صلابة الناتجة عن طريق تغيير نسبة PEG الوزن. أنتجت الهلاميات المائية مع اختلاف٪ من وزن 10 كيلو دالتون PEGDM الخطية، وتم تحديد صلابة وحجم شبكة هيدروجيل كما هو موضح سابقا (الشكل 9). كما هو موضح في الشكل 7B، وزيادة٪ بالوزن يسبب PEG انخفاض ملحوظ في حجم شبكة (الشكل 9A) وزيادة في صلابة هيدروجيل (الشكل 9B). وتم تشكيل الهلاميات المائية تحتوي على مغلفة ألبومين المصل البقري (BSA) باستخدام البيولوجيا متفاوتةص الوزن PEG (2، 10، و 20 كيلو دالتون). أنتجت كل الهلاميات المائية مع 10٪ بالوزن PEGDM في برنامج تلفزيوني يحتوي على 50 ميكروغرام / مل جيش صرب البوسنة، كما هو موضح لشكل 6. وحضنت المواد الهلامية في 1 مل PBS عند 37 درجة مئوية، ونقل إلى برنامج تلفزيوني جديد في كل نقطة زمنية. وكان كميا BSA أفرج عنه باستخدام برادفورد الفحص من الحرارية العلمية. تم تحديد حجم شبكة هيدروجيل كما هو موضح الشكل 8. كما هو موضح في الشكل 7A، يحدث الإفراج BSA بسرعة أكبر من الهلاميات المائية تشكيلها باستخدام أعلى الجزيئية PEGDM الوزن، ونتيجة لحجم أكبر شبكة داخل هيدروجيل (الشكل 10). الشكل 4. بين functionalized ممثل 1 H-NMR من 2 كيلو دالتون الخطية PEGDM باستخدام طريقة بمساعدة الميكروويف. نسبة functionalization يمكن أن يكون كاليفورنيا lculated على أساس احظ: نسبة النظرية البروتونات ميتاكريليت محطة (أ، ب، ج) لالبروتونات PEG المركزية (د) اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . الرقم 5. ممثل MALDI-TOF من الببتيد GKRGDSG (A) من قبل و(B) بعد functionalization باستخدام طريقة بمساعدة الميكروويف. لاحظ أن لاحظ الجزيئية الذروة الوزن بعد functionalization يحدث في 744 جم / مول، والوزن المتوقعة للmethacrylamide بين functionalized الببتيد (676 +68 ز / مول) وليس على الوزن الجزيئي المتوقع للامم المتحدة بين functionalized الببتيد (676 جم / مول). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . <p class="jove_content" fo:keep-together.within صفحة = "دائما"> الرقم 6. النقيض من المرحلة ممثل (يسار) ويعيش / ميت (أخضر / أحمر) الصور الفلورسنت (يمين) من اللجان الدائمة مثقف على المواد الهلامية A) PEG وحده، وB) الهلام تحتوي على 0.5 ملي PEG methacrylamide GKRGDSG بين functionalized. اللجان الدائمة غير قادر على الالتزام وتنتشر على المواد الهلامية PEGDA وحدها، ولكن عند إدراج خلية التصاق الببتيد RGD، قادرون على الالتزام وتنتشر على سطح هيدروجيل. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . الرقم 7. A) PEG الوزن الجزيئي وB) نسبة الوزن PEG تستخدم لتشكيل شبكات هيدروجيل يؤثر هيدروجيل حجم شبكة (_8 ؛) والناتجة هيدروجيل صلابة ومعدل المخدرات مغلفة إطلاق سراح ألف) زيادة PEG الوزن الجزيئي (من اليسار إلى اليمين) في نسبة وزنها بشكل مستمر يزيد من حجم شبكة هيدروجيل، وخفض هيدروجيل صلابة وزيادة معدل الافراج عن المخدرات. ب) خفض الوزن تستخدم نسبة PEG (من اليسار إلى اليمين) لتشكيل الهلاميات المائية يزيد حجم شبكة هيدروجيل، وخفض مماثل هيدروجيل صلابة وزيادة معدل الافراج عن المخدرات (وليس لتوسيع نطاق). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . الرقم 8. أ) يقلل زيادة حجم شبكة وB) هيدروجيل صلابة مع زيادة الوزن الجزيئي للmacromer PEG. ن = 10، أشرطة الخطأ = SEM، ص *** و# 60؛ 0.001 من جانب واحد في اتجاه وأنوفا مع HSD اختبار بعد مخصصة توكي. أجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام بريزم 5. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . الرقم 9. أ) مش انخفاض حجم وباء) زيادة صلابة هيدروجيل مع زيادة بالوزن٪ PEG. ن = 9-10، أشرطة الخطأ = SEM، ** ع <0.01 ***، ع <0.001 من قبل في اتجاه واحد أنوفا مع HSD توكي بعد اختبار خاص. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . الرقم 10. إطلاق سراح جراميحدث نموذج psulated الأبقار مصل الزلال المخدرات (BSA) من الهلاميات المائية شكلت باستخدام 2 كيلو دالتون و 10 كيلو دالتون، 20 كيلو دالتون الوزن الجزيئي PEG. الإفراج BSA بسرعة أكبر من الهلاميات المائية تشكيلها باستخدام الوزن الجزيئي العالي PEGDM، نتيجة لحجم أكبر شبكة داخل هيدروجيل . ن = 6، أشرطة الخطأ = SEM. جيش صرب البوسنة٪ صدر تختلف اختلافا كبيرا (ع <0.0001) بين المجموعات الثلاث في كل نقطة زمنية ما عدا ر = 1 و 2.5 ساعة عند الإفراج عن 2 و 10 كيلو دالتون المواد الهلامية متكافئين، من خلال اتجاهين تدابير تكرار أنوفا مع Bonferroni آخر مخصص للتجارب. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Discussion

الأساليب يتضح سابقا لا تقدر بثمن لتجميع PEGDM وmethacrylamide functionalization من الببتيدات أو المركبات المحتوية على الأمينات الأخرى. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم هذه المواد للطب التجديدي وتطبيقات تسليم المخدرات. نظرا لطبيعة ماء من PEG، الهلاميات المائية التي تشكلت من macromers PEG لديهم نسبة عالية من المياه على غرار العديد من الأنسجة في الجسم ^2. هذه النوعية يجعل PEG جدا مقاومة للامتصاص البروتين وبالتالي الخاملة في الجسم ^3. ومع ذلك، فإن طبيعة استرطابي من PEG يمكن أن تثبت مزعجة أثناء functionalization. إذا كان الماء موجودا في العينة PEG أثناء إجراء methacrylation، فإن أنهيدريد ميثاكريليك تتفاعل بشكل تفضيلي مع الماء لإنتاج حمض ميثاكريليك، وسوف الفقراء functionalization من PEG ينتج.

وبالتالي، واحدة من أهم الخطوات التي يمكن اتخاذها لضمان methacrylation الناجح لPEG أو الببتيد هو الحفاظ على anhydظروف التفاعل الروس. والمقصود الخطوة الموصى بها من تجفيف جميع الأواني الزجاجية قبل استخدامها لمنع تلوث المياه. ويمكن رؤية وجود الماء في العينة في تحليل NMR، وذروة واسع في جزء من المليون 1.7 (الشكل 4). إذا لوحظ الفقراء methacrylation حتى بعد تجفيف جميع الأواني الزجاجية، ويمكن أن تجفف المواد الكيميائية على سلفات الصوديوم أو وكلاء التجفيف الأخرى (المناخل الجزيئية الخ) قبل استخدامها. ويمكن أيضا أن تستخدم التقطير لإزالة المياه وتنقية أنهيدريد ميثاكريليك قبل استخدامها، والتقطير ازوتروبيه يمكن استخدامها لتجف PEG ^23. في الحالات القصوى، والتوليف يمكن القيام بها في صندوق قفازات لضمان مزيد من الشروط اللامائية على نحو كاف. ويمكن أيضا الجولة الثانية من methacrylation، باتباع نفس الإجراء، يتم تنفيذها لزيادة functionalization. لأن هناك دائما فرصة التي ستكون مطلوبة جولات إضافية من functionalization، ينبغي توخي الحذر في الخطوة 1.7 و 1.9 لجمع PEGDM بسرعة عن طريق الترشيح فراغ. الترشيح الفراغ لفترة أطول مما هو ضروري للغاية الزيادات تعرض PEG إلى الهواء، وزيادة الفرصة لامتصاص المياه.

على الرغم من أن الزائدة في المئة من أنهيدريد ميثاكريليك إلى جماعات وظيفية الهيدروكسيل لم يتغير، وزيادة functionalization PEG (على سبيل المثال الذراع #) على السلائف PEG يرتبط عموما مع انخفاض في المئة functionalization حققت (نتائج غير منشورة، بنوا المختبر). استباقي لمواجهة هذا الانخفاض في الكفاءة functionalization، أو إذا واجهت صعوبات خاصة تحقيق functionalization عالية بما فيه الكفاية، ويمكن زيادة مدة رد الفعل الميكروويف، شريطة أن يكون الفاصل الزمني الميكروويف يتم الاحتفاظ في 30 ثانية. في حين أن 10 الزائدة المولي يكفي عادة، كما يمكن زيادة كمية أنهيدريد ميثاكريليك المستخدمة في رد فعل على زيادة functionalization في المئة حققت ^12.

من المهم أنهطول خطوة إضافية (1.9) أن يؤديها لتحقيق NMR إشارات جيدة. في حين أنه من المغري لأداء هطول الثانية في نفس اليوم الذي التوليف، تجفيف العينة بين عشية وضحاها قبل وقد وجد reprecipitating للمساعدة في إزالة الزائدة أنهيدريد ميثاكريليك وحمض ميثاكريليك. إعداد نموذج المهم أيضا لتحقيق نظيفة NMR الأطياف، وبالتالي ينبغي إعداد العينات باستخدام الظروف الموصى بها. الشكل 4 يوضح ممثل النتائج ¹ H-NMR لPEGDM بين functionalized بشكل صحيح. من خلال تحليل نسبة البروتونات ميتاكريليت محطة لالبروتونات PEG المركزية، تم تحديد PEGDM أن بين functionalized بشكل كاف. إعداد نموذج MALDI المهم بالمثل لتحقيق قراءة واضحة. MALDI حساسة بشكل خاص إلى وجود تركيزات الأملاح وعينة عالية. إذا كان MALDI واضحة القراءة (كثافة أعلى من 50 وحدات التعسفي (الاتحاد الافريقي) مع إشارة عالية: نسبة الضوضاء) لا يمكن الحصول عليها، وعينة ثانيةيجب تخفيفه olution 1:100 في MALDI المذيبات قبل أن يتم جنبا إلى جنب مع حل المصفوفة وأعادوا تحليل الشكل 5 يوضح النتائج MALDI-TOF ممثل الصحيح بعد functionalization الببتيد، الانقسام، وإعداد العينات. الانقسام لعينة صغيرة من الراتنج قبل functionalization (الشكل 5A) يبين التوليف الصحيح للGKRGDSG الببتيد، مع الصحيح functionalization methacrylamide من الببتيد هو مبين في الشكل 5B.

بينما functionalization من على الراتنج الببتيدات هو إجراء قوي نسبيا، وظروف الانقسام المطلوبة لكل تسلسل غالبا ما يتطلب ضبط. لمتواليات طويلة حيث العديد من الأحماض الأمينية قد حمت السلاسل الجانبية (> 30 الأحماض الأمينية طويلة، أو> 15 الأحماض الأمينية مع حماية الفئات)، ينبغي زيادة مدة الانقسام ساعة واحدة. ومع ذلك، إذا تم تمديد وقت الانقسام كثيرا، قد يؤدي الانقسام السندات الببتيد بسبب التعرض الحمضية على المدى الطويل. MALDI آنا تحلل يمكن أن تكون مفيدة جدا في الكشف عن أية أخطاء التي وقعت في التوليف الببتيد أو الانقسام. لوحظ انخفاض أقل من المتوقع الأوزان الجزيئية يمكن أن تشير إلى أن الأحماض الأمينية (ق) لم يكن بشكل صحيح الزوجين، أو حدث أن تجزئة الببتيد (انظر الجدول رقم 2 عن مصادر التغيرات الملحوظة في الوزن الجزيئي عادة). إذا كان الوزن الجزيئي الملحوظ هو أعلى مما كان متوقعا من الوزن من مجموعة حماية المستخدمة، فمن المحتمل أن الانقسام وdeprotection لم يكن كافيا، وينبغي recleaved الببتيد لوقت إضافي.

س؛ "> تغير ميغاواط (ز / مول) <نمط الدفتيريا = "العرض: 64px؛"> +24 البيوت: 64px؛ "> -113 03px؛ "> برو 20 "على غرار =" الطول: 20px؛ العرض: 103px؛ "> صور

حمض أميني الحذف	التغيير ميغاواط (ز / مول)	المجموعات حماية Uncleaved	الأيونات الموجودة عادة	التغيير ميغاواط (ز / مول)
علاء	-71	الاسيتيل	+42	CL ^–	+35
ARG	-158	الآليل	+40	K ⁺	+39
ASN	-114	الوك	+85	² ملغ ⁺
آسيا والمحيط الهادئ	-115	بنك الصين	+100	غ ⁺	+23
السيستئين	-103	Fmoc	+223
GLN	-128	OtBu	+56
غلو	-129	PBF	+252
الغليسين	-57	TBU	+56
له	-137	TRT	+242
إيل	-113
بادئة معناها أبيض
ليز	-128
التقى	-131
الظواهر	-147
-97
سر	-87
عبتي	-101
التربتوفان	-186
-147
فال	-99

الجدول 2. لاحظ عادة التغيرات في الببتيد الوزن الجزيئي.

Macromers المنتجة باستخدام أساليب methacrylation بمساعدة الميكروويف يمكن استخدامها في عدد من التطبيقات الطب التجديدي أو تسليم المخدرات. ويمكن أيضا أن تدمج بين functionalized الببتيدات وPEGDM تصنيعه هنا في البوليمرات باستخدام Nitroxide بوساطة البلمرة (NMP)، حوالة اتوم الراديكالي البلمرة (ATRP) أو عكسها عدينقل نشوئها-تجزئة (الطوافة) الأساليب ^24. ويمكن أيضا أن تنتج شبكات هيدروجيل في وجود خلايا، كما هو موضح سابقا في المقالة إن الرب بواسطة خيطان وBurdick ^و22. هذا وغالبا ما يتطلب إدماج الببتيدات التصاق الخلية مثل RGD أو جزيئات المصفوفة خارج الخلية، كما PEG وحده لا يوفر التفاعلات الخلية المواد حاسم لبقاء وظيفة لبعض أنواع الخلايا ^25. الببتيدات، على سبيل المثال، يمكن توليفها باستخدام التقليدية الببتيد التوليف الصلبة مرحلة وبين functionalized كما هو موضح هنا للسماح لإدماجها في شبكات هيدروجيل. كما رأينا في الشكل (6)، وإدراج للالتصاق الخلية methacrylamide بين functionalized الببتيد GK RGDS G في الهلاميات المائية (0.5 ملم) يسهل التصاق الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (اللجان الدائمة) لPEG السطوح هيدروجيل، وزيادة عدد الخلايا المرفقة ونشر (الشكل 6B )، مقارنة ب PEG الهلاميات المائية دون الببتيد التصاق الخلية ( <strأونج> الشكل 6A). ومع ذلك، فقد أظهرت الأعمال السابقة أن التفاعلات الخلية المواد ويزيد من حدتها إدراج 3،400 الفواصل دا PEG بين الببتيدات لاصقة وشبكات هيدروجيل، للحد من الببتيد إنتغرين الفراغية عائق. دون إدراج الفاصل، قد تتفاعل مع خلايا الهلاميات المائية PEG عبر البروتينات غير محددة أن كثف لالببتيد، وليس من خلال التفاعلات التي تتوسط إنتغرين مع الببتيدات ^26. لإدراج هذا الفاصل PEG وتجنب التفاعلات غير محددة، والببتيدات يمكن مترافق إلى monofunctionalized PEG عبر N-تنشيط hydroxysuccinimidyl استرات، كما وصفها هيرن وهوبيل ^26.

تطبيقات الشبكات هيدروجيل تتطلب رقابة مشددة على خصائص المواد. وهناك ميزة هامة لالهلاميات المائية PEG هو على درجة عالية من السيطرة على هذه الخصائص. على سبيل المثال، الوزن الجزيئي، الذراع العدد، و٪ من وزن PEG المستخدمة في تشكيل شبكات هيدروجيل يمكن تغييرها لغرامة-تونالخصائص الإلكترونية لتطبيقات محددة. وهذا يسمح رقابة مشددة على هيدروجيل حجم شبكة (ξ)، التي تسيطر على هيدروجيل تورم نسبة (س) وتصلب (معامل المرونة، E). ويتضح هذا في الشكل 7A وكميا في الشكل 8، حيث تزداد PEG macromer النتائج الوزن الجزيئي في زيادة في حجم هيدروجيل شبكة (الشكل 8A) وانخفاض في هيدروجيل صلابة (الشكل 8B).

السمة المادية الكامنة التي تسيطر على السلوك الأكبر في هذه الشبكات هيدروجيل، وحجم شبكة، يتم حسابها باستخدام معادلة فلورى-Rehner ^16. لأداء هذا الحساب، ويتم احتساب نسبة التورم الحجمي (س) أول من المعادلة 4:
(4)

حيث ρ _و هو كثافة الماء (1 جم / مل)، ρ _p هو كثافة PEG (1.12 جم / مل)، M _و هي كتلة متورمة من هيدروجيل وM _D والكتلة الجافة من هيدروجيل (غالبا ما تقاس بعد تجميد وتجفيد من الهلاميات المائية). ثم يتم حساب الوزن الجزيئي بين crosslinks (M _ج، ز في / مول) من المعادلة (5):
(5)

حيث M _N هو عدد ميغاواط المتوسط من PEG (في غرام / مول)، هو الحجم النوعي للبوليمر ، V ₁ هو الحجم المولي للمياه (18 مل / مول)، والخامس ₂ هو جزء من حجم التوازن البوليمر من هيدروجيل
( )، وX ₁ </فرعية> هو المعلمة تفاعل البوليمر مذيب للPEG والمياه (0.426) ^16. ثم يتم حساب عدد الروابط بين crosslinks (ن) من المعادلة (6):
(6)

حيث N _ب هو عدد السندات في تكرار PEG (3) وM _r هو ميجاوات من تكرار PEG (44 جم / مول) ^27. وهذا يسمح للمسافة جذر متوسط مربع نهاية إلى نهاية سلسلة البوليمر (في نانومتر) يتم حسابها من المعادلة (7):
(7)

حيث l هو متوسط طول الرابطة (0.146 نانومتر، وتحسب على أساس CC CO أطوال والسندات) وC _n هو نسبة مميزة من البوليمر (4.0 ل PEG) ^28. فاينالي، وحجم شبكة من هيدروجيل يمكن حسابها من المعادلة (8):
(8)

يمكن بالمثل خصائص هيدروجيل يتم ضبطها عن طريق ضبط كمية من PEG المستخدمة في تشكيل الهلاميات المائية. خفض نسبة وزن النتائج macromer PEG إلى زيادة في حجم شبكة هيدروجيل، مما يقلل بالتالي هيدروجيل صلابة. يوضح الشكل 7B والشكل 9 يحدد مدى نسبة وزن PEG المستخدمة في تشكيل هيدروجيل يمكن استخدامها للسيطرة على حجم شبكة (الشكل 9A) وينتج تصلب هيدروجيل (الشكل 9B). كما لم تظهر صلابة الركيزة تؤثر على سلوكيات الخلية مثل الخلايا الجذعية التمايز ^29، والقدرة على السيطرة بإحكام صلابة هو سمة مهمة في هيدروجيل تلفيق.

ويمكن أيضا أن تستخدم لالهلاميات المائية مقاولاتتسليم المخدرات رأ. كما هو موضح في الشكل 7A وموضح في الشكل 10، وزيادة الوزن الجزيئي للmacromers PEG يزيد حجم شبكة شبكة هيدروجيل، وزيادة في وقت لاحق بالإفراج عن المخدرات مغلفة نموذج، ألبومين المصل البقري (BSA). في حين تم تدمير العينات هيدروجيل في هذه الدراسة في ر = 195 ساعة للسماح لقياس هيدروجيل الجماهير الرطب والجاف لإجراء العمليات الحسابية حجم شبكة، فمن تجربتنا التي استمرت من شأنه أن يحدث إطلاق BSA ان عينات تم المحتضنة لفترات زمنية أطول. الإفراج غير مكتملة من BSA لوحظ في الشكل 10 ليست غير متوقعة، كما أفادت جماعات أخرى أيضا أن جيش صرب البوسنة هو مقاومة للنشر ضمن شبكات هيدروجيل PEG ^30. يمكن أن يحدث الافراج غير مكتملة من البروتين مغلفة بسبب الرابطة الهيدروجينية بين البروتينات وmacromers PEG، أو التساهمية ملزم بين مجموعة ميتاكريليت على PEG والجماعات أمين الأولية على بقايا يسين في جيش صرب البوسنة ³¹ </sتصل>. بالإضافة إلى ذلك، BSA عرضة لتجميع وتشكيل السندات ثاني كبريتيد مع مرور الوقت، والتي يمكن أن تزيد من دائرة نصف قطرها ستوكس فعالة وعرقلة صدوره من الهلاميات المائية. كما الهلاميات المائية سلسلة النمو، مثل هذه الهلاميات المائية PEGDM، عرضة للnonidealities الشبكة وهيدروجيل غير متجانسة حجم شبكة (الشكل 2A)، فمن الممكن أيضا أن جزءا من جيش صرب البوسنة مغلفة يرد في مناطق هيدروجيل التي لديها شبكة أصغر بكثير الحجم من المعدل العام داخل هلام، ومنع صدوره. في حين لوحظ ناقصة، وإطلاق سراح nonFickian (لا تظهر البيانات) من مغلفة BSA في هذه الحالة، وإطلاق سراح Fickian تسيطر على العديد من الأدوية نموذج آخر، بما في ذلك الأنسولين وألبومين البيض، فقد ثبت استخدام PEGDM مماثلة الهلاميات المائية ^30. بالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت واتكينز وAnseth متحد البؤر المسح المجهري بالليزر لإثبات أن الإفراج عن جزيئات الفلورسنت من الهلاميات المائية مماثلة على غرار مقبول مع نشر Fickian ليthods ^32.

في حين أن الهلاميات المائية التي تشكلت في هذه الدراسة هي nondegradable، وتدهور الشبكة هو مقياس آخر التي يمكن إدراجها في وضبطها داخل هذه الشبكات. يمكن توفير لتدهور هيدروجيل تسيطر يؤدي إلى تغييرات في سلوك الخلية ^33، وتعزيز نمو الأنسجة أو الأنسجة المضيفة نشوب، أو القضاء على الحاجة إلى explantation ^34. وقد تم تجميع الهلاميات المائية القابلة للتحلل PEG عادة من قبل عصابة فتح د تحلل هيدروليكيا، L-lactide، glycolide، أو مجموعات ε-caprolactone على مجموعات الهيدروكسيل داخل PEG قبل methacrylation ^35. هذه المجموعات الثلاث تتحلل بواسطة التحلل من وظائف استر، مع وجود استرات glycolide أكبر قابلية للتحلل، تليها lactide، وcaprolactone استر، وذلك بسبب للا مائية متفاوتة بهم. بعد إدراج مجموعات تحلل هيدروليكيا، PEG يمكن بين functionalized مزيد باستخدام methacrylation الإجراء detaileد في هذه المقالة، وتمكين تشكيل شبكات هيدروجيل من خلال اللاحقة الراديكالية بدأت سلسلة البلمرة ^36،37. يمكن التحكم في معدل تدهور شبكات هيدروجيل من خلال تغيير هوية المجموعة تحلل هيدروليكيا (glycolide، lactide، الخ)، ومتفاوتة في عدد من يكرر تحلل إدراجها في هيكل ^35،38.

من الناحية النظرية، وأساليب أثبتت هنا يمكن أن تستخدم لacrylation من PEG والببتيدات عن طريق استبدال أنهيدريد ميثاكريليك مع أنهيدريد الاكريليك في الخطوات 1.3 و 3.3 على التوالي. ومع ذلك، أنهيدريد الاكريليك هو أكثر من 20 أضعاف تكلفة أنهيدريد ميثاكريليك ^39،40، مما يجعل acrylation بمساعدة الميكروويف بشكل ملحوظ أقل جاذبية من methacrylation بمساعدة الميكروويف.

لقد أثبتنا ذلك، طريقة سريعة بسيطة لfunctionalize PEG والببتيدات، وكيفية تقييم كفاءة هذا الإجراء، ونظرا الموارد لأجلكالغناء المواد توليفها لتشكيل شبكات هيدروجيل. هذه الأدوات الاصطناعية وتنوعا للغاية في التطبيقات الخاصة بهم، ويجب أن يثبت العنصر الرئيسي في أي عدد من المواد وتسليم المخدرات مختبرات البحوث.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من زمالة هوارد هيوز ميد حيز غراد (AVH)، من أموال لبدء المقدمة إلى الدكتور دانييل بنوا من جامعة روشستر ومؤسسة البحوث والتعليم العظام / زرع العظام والعضلات مؤسسة (OREF / MTF). فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور جيمس ماكغراث لاستخدام معداته.

Materials

3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol	Tokyo Chemical Industry Co, LTD	D2649	CAS 14970-87-7
Acetonitrile	J.T. Baker	UN1648	CAS 75-05-8
Amino Acids	AAPPTech	Glycine: AFG101	CAS 29022-11-5
		Arginine: AFR105	CAS 154445-77-9
		Asparagine: AFD105	CAS 71989-14-5
		Serine: AFS105	CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether	Fisher Scientific	UN1155	CAS 60-29-7
Citric acid	Sigma Aldrich	C1857	CAS 77-92-9
Deuterated chloroform	Cambridge Isotope Laboratories Inc.	DLM-7-100	CAS 865-49-6
Dichloromethane	Fisher Scientific	UN1593	CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A1181	CAS 7087-68-5
Dimethylformamide	Fisher Scientific	D119-4	CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin	Peptides International	RGF-1301-PI	100-200 mesh size
Methacrylic anhydride	Alfa Aesar	L14357	CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone	VWR	BDH1141-4LG	CAS 872-80-4
On-resin peptides	Synthesized in-house		On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate	AnaSpec Inc	510/791-9560	CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard	Care	206195
Piperazine	Alfa Aesar	A15019	CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear	Alfa Aesar	B22181	CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear	Alfa Aesar	B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear	Sigma Aldrich	81300	JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole	Alfa Aesar	L5464	CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198	CAS 76-05-1
Triisopropylsilane	Alfa Aesar	L09585	CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Tokyo Chemical Industry Co, LTD	C1768	CAS 28166-41-8

Referências

Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG Hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine. Pharm. Res. 26, 631-643 (2009).
Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Eng. 13, 2369-2385 (2007).
Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology. Adv. Mater. 18, 1345-1360 (2006).
Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat. Biotechnol. 23, 47-55 (2005).
Benoit, D. S., Durney, A. R., Anseth, K. S. The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Biomaterials. 28, 66-77 (2007).
Benoit, D. S., Collins, S. D., Anseth, K. S. Multifunctional hydrogels that promote osteogenic human mesenchymal stem cell differentiation through stimulation and sequestering of bone morphogenic protein 2. Adv. Funct. Mater. 17, 2085-2093 (2007).
Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of Poly(Ethylene Glycol) Diacrylate Hydrogels with Biomolecules to Regulate and Guide Endothelial Morphogenesis. Tissue Eng. A. 15, 579-585 (2009).
Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, 4315-4323 (2002).
Yanez-Soto, B., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Biochemically and topographically engineered poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomimetic characteristics as substrates for human corneal epithelial cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 101A, 1184-1194 (2013).
Benoit, D. S. W., Anseth, K. S. Heparin functionalized PEG gels that modulate protein adsorption for hMSC adhesion and differentiation. Acta Biomater. 1, 461-470 (2005).
Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
Anseth, K. S., Wang, C. M., Bowman, C. N. Reaction Behavior and Kinetic Constants for Photopolymerizations of Multi(Meth)Acrylate Monomers. Polymer. 35 (94), 3243-3250 (1994).
Bencherif, S. A., et al. End-group effects on the properties of PEG-co-PGA hydrogels. Acta Biomater. 5, 1872-1883 (1016).
Rydholm, A. E., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Degradable thiol-acrylate photopolymers: polymerization and degradation behavior of an in situ forming biomaterial. Biomaterials. 26, 4495-4506 (2005).
Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules. 11, 1348-1357 (2010).
Malkoch, M., et al. Synthesis of well-defined hydrogel networks using Click chemistry. Chem. Commun. , 2774-2776 (2006).
Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Emerging Ideas: Engineering the Periosteum: Revitalizing Allografts by Mimicking Autograft. , (2012).
Hoffman, M. D., Xie, C., Zhang, X., Benoit, D. S. The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allograft healing. Biomaterials. , (2013).
Hubbell, J. A., Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N. Cell-responsive synthetic hydrogels. Adv. Mater. 15, 888-892 (2003).
Lidstrom, P., Tierney, J., Wathey, B., Westman, J. Microwave assisted organic synthesis – a review. Tetrahedron. 57, 9225-9283 (2001).
Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J. Vis. Exp. (32), e1590 (2009).
Antonios, M., Kurtis, K., Lucas, K. Drying poly(ethylene glycol). Nat. Protoc. Exchange. , (2012).
Nicolas, J., Mantovani, G., Haddleton, D. M. Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates. Macromol. Rapid Comm. 28, 1083-1111 (2007).
Nuttelman, C. R., Benoit, D. S. W., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. The effect of ethylene glycol methacrylate phosphate in PEG hydrogels on mineralization and viability of encapsulated hMSCs. Biomaterials. 27, 1377-1386 (2006).
Hern, D. L., Hubbell, J. A. Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing. J. Biomed. Mater. Res. 39, 266-276 (1998).
Andreopoulos, F. M., Beckman, E. J., Russell, A. J. Light-induced tailoring of PEG-hydrogel properties. Biomaterials. 19, 1343-1352 (1998).
Merrill, E. W., Dennison, K. A., Sung, C. Partitioning and Diffusion of Solutes in Hydrogels of Poly(Ethylene Oxide). Biomaterials. 14, 1117-1126 (1993).
Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90A, 720-729 (2009).
Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. Release of protein from highly cross-linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization. Biomaterials. 22, 929-941 (2001).
Watkins, A. W., Anseth, K. S. Investigation of molecular transport and distributions in poly(ethylene glycol) hydrogels with confocal laser scanning microscopy. Macromolecules. 38, 1326-1334 (2005).
Anseth, K. S., Benoit, D. S. W., Durney, A. R. Manipulations in hydrogel degradation behavior enhance osteoblast function and mineralized tissue formation. Tissue Eng. 12, 1663-1673 (2006).
Hillwest, J. L., et al. Prevention of Postoperative Adhesions in the Rat by in-Situ Photopolymerization of Bioresorbable Hydrogel Barriers. Obstet. Gynecol. 83, 59-64 (1994).
Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. Bioerodible Hydrogels Based on Photopolymerized Poly(Ethylene Glycol)-Co-Poly(Alpha-Hydroxy Acid) Diacrylate Macromers. Macromolecules. 26, 581-587 (1993).
Skaalure, S. C., Milligan, I. L., Bryant, S. J. Age impacts extracellular matrix metabolism in chondrocytes encapsulated in degradable hydrogels. Biomed. Mater. 7, 024111-0210 (2012).
Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion. J. Tissue. Eng. Regen. Med. , (2013).
Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Vanrensburg, J. J., Dunn, R. C., Hubbell, J. A. Optimization of Photopolymerized Bioerodible Hydrogel Properties for Adhesion Prevention. J. Biomed. Mater. Res. 28, 831-838 (1994).
. Methacrylic Anhydride [Internet] Available from: https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18 (2013)

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. W. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).