Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual
Summary
Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.
Abstract
En los últimos años, dos fotones de imágenes se ha convertido en una herramienta muy valiosa en la neurociencia, ya que permite la medición de crónica de la actividad de las células identificadas genéticamente durante comportamiento 1-6. Aquí se describen los métodos para llevar a cabo de dos fotones en la corteza del ratón mientras el animal se desplaza un entorno de realidad virtual. Nos centramos en los aspectos de los procedimientos experimentales que son clave para obtener imágenes en un animal se comporta en un entorno virtual muy iluminada. Los principales problemas que se presentan en este montaje experimental que aquí la dirección estamos: minimizando los artefactos de movimiento relacionadas con el cerebro, reduciendo al mínimo la fuga de luz del sistema de proyección de realidad virtual, y minimizando el daño tisular inducida por láser. También proporcionamos software muestra para controlar el entorno de realidad virtual y de hacer el seguimiento de los alumnos. Con estos procedimientos y recursos debería ser posible convertir un microscopio de dos fotones convencional para su uso en comportarse ratones.
Introduction
Dos fotones de imágenes de los indicadores de calcio (genéticamente codificados como GCaMP5 7 o R-GECO 8, o colorantes sintéticos como OGB o Fluo4) ha emergido como un poderoso método para medir la actividad neuronal en ratones comportarse 1-6. Se permite la medición simultánea de la actividad de cientos de células en acción cerca de un solo potencial de resolución, de hasta aproximadamente 800 m por debajo de la superficie del cerebro 9,10. Por otra parte, el uso de indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) la actividad neuronal se puede medir crónicamente 5,11,12, y en tipos de células genéticamente definidas 13. En conjunto, estos métodos proporcionan un grado de resolución temporal y espacial que abre una multitud de nuevas posibilidades en el estudio de la computación neuronal in vivo.
La intervención quirúrgica es necesaria para exponer y etiquetar el cerebro de un ratón para la imagen. Las células se transfectaron usando típicamente un Vir adeno-asociado recombinante nos sistema (AAV) para la entrega GECI y una ventana craneal se implanta en el sitio de la inyección para obtener acceso óptico al cerebro. Un bar de la cabeza se une entonces al cráneo para la fijación de la cabeza bajo el microscopio de dos fotones. El diseño y la implementación de estas medidas es fundamental ya que la mayoría de los problemas con las imágenes despierto surgen de la inestabilidad en la preparación. Idealmente, el procedimiento descrito aquí debe permitir para formación de imágenes crónica de hasta varios meses después de la cirugía.
Para habilitar el comportamiento guiado visualmente durante dos fotones de imágenes, el ratón fijo cabeza se sienta en una cinta de correr esférica aire apoyado, que puede utilizar para navegar por un entorno de realidad virtual. Locomoción del ratón en la cinta se acopla al movimiento en el entorno virtual que se muestra en una pantalla toroidal que rodea el 14,15 ratón. Variables de comportamiento, tales como locomoción, el estímulo visual, y la posición de la pupila se pueden grabar 6.
t "> Se describen los procedimientos involucrados en la crónica de dos fotones en ratones explorando un entorno de realidad virtual Los puntos clave abordados son:. reducción de artefactos de movimiento, la reducción de la fuga de luz, la maximización del número de células grabadas de forma simultánea, y la minimización de el daño por luz. También dio detalles sobre la configuración de la rueda de ardilla hinchable, el seguimiento de los alumnos, y el entorno de realidad virtual. Los procedimientos descritos aquí se pueden utilizar para obtener imágenes de las poblaciones de células marcadas con fluorescencia en ratones fijos en la cabeza en un potencialmente amplia variedad de paradigmas de comportamiento .Protocol
Representative Results
Discussion
La clave para el éxito de comportamiento de formación de imágenes de dos fotones es la estabilidad de la preparación de dos maneras:
- En el transcurso de la implantación ventana días post, respuestas inflamatorias del tejido pueden conducir a la mejora de la formación de tejido de granulación y el cartílago que dificultar o incluso impedir formación de imágenes.
- Durante el experimento, el cerebro tiene que ser lo suficientemente estable para evitar los artefactos de movimiento corrompa l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Friedrich Miescher para la Investigación Biomédica, la Sociedad Max Planck y el Programa Científico Fronteras Humanos.
Materials
| cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
Referências
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