Summary

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

Published: November 18, 2013
doi:

Summary

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

Abstract

מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי מערכת עצבים מרכזית התחדשות (CNS) וtumorigenesis כרוך אוכלוסיות של תאי גזע (SCS) תושב בתוך המוח הבוגר. עם זאת, מנגנוני תאים בדרך כלל שקטים אלה מעסיקים על מנת להבטיח תפקוד תקין של רשתות עצביות, כמו גם את תפקידם בהחלמה מפציעה וההפחתה של תהליכי ניוון עצבי הם הבינו מעט. תאים אלה מתגוררים באזורים המכונים "נישות" המספקות סביבה תומכת מעורבת אותות ויסות משני כלי הדם ומערכת חיסונית. הבידוד, התחזוקה, והבידול של SCS במערכת העצבים המרכזית בתנאי תרבות מוגדרים שלא לכלול גורמים לא ידועים, הופכים אותם נגיש לטיפול באמצעים תרופתיים או גנטיים, ובכך לספק תובנות על התנהגות in vivo שלהם. כאן אנו מציעים מידע מפורט על השיטות להפקת תרבויות של SCS מערכת העצבים המרכזית מאזורים שונים של המוח המבוגר וגישות להערכת דפוטנציאל ifferentiation לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes במבחנה. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תאים הומוגנית כתרבות monolayer שיכול להיות דמיינו ללמוד SCs פרט וצאצאיהם. יתר על כן, ניתן להחיל אותו על פני מערכות מודל של בעלי החיים שונות ודגימות קליניות, שהשתמש בעבר כדי לחזות את תגובות משובי במערכת העצבים למבוגרים הפגועה.

Introduction

הדוגמה המרכזית לנוירוביולוגיה, שנקבעה על ידי התצפיות הבסיסיות של cytoarchitecture המוח שנעשה על ידי רמון קחל י 'לפני למעלה ממאה שנים, קבעה כי נוירוגנזה הייתה סבירה לאחר גיל ההתבגרות בהתחשב במורכבות של הרשתות עצביות שנמצאו במערכת העצבים המרכזית 1. למרות עבודתו של אלטמן ב1960s, ומאוחר יותר קפלן, הוכחת כי 3 H-תימידין אפשר היה לציין בתאים בוגרים מצביעים על כך שלמעשה היו נוירונים שנוצרו באזורים שונים של המוח הבוגר, הדוגמה המשיכה להחזיק 2, 3. ראיות המשיכו לעלות עם המחקר של Nottebohm המתאר את השינויים העונתיים במספר הנוירונים במוח של ציפור השיר נוכחי 4. זה לא היה עד 1999, כאשר גולד ואח' עבודה. פורסם על הדור של נוירונים בהיפוקמפוס העליות עם הביצועים של משימות למידה אסוציאטיביות בחולדה, כמו גם התצפיות של הפגנות Kornack וRakicטינג המשיך נוירוגנזה במקוק המבוגר שהקונספט של מוח פחות נוקשה, פלסטיק יותר, הוכר 5, 6.

החיפוש אחר המקור הסלולרי לדה נובו הנוירונים שנוצרו אלה להוביל לגילוי של אוכלוסייה נפרדת של תאי גזע (SCS) שמתגוררות באזורים במוח המכונה נישות 7. אזור subventricular והאזור גרעיני תת של ההיפוקמפוס נחשבים לשני האזורים העיקריים נוירוגנית 8,9. תאים מבודדים ממקומות אלה להציג את המאפיין הקלאסי של SCS נגזר עוברי או עוברי, התחדשות עצמית ואת פוטנציאל התמיינות. במקרה של תאי גזע עצביים (NSCs), הם יכולים להיות מובחנים לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. בנוסף, SCS אלה להכתים חיוביים לסמני NSC עובריים כגון nestin חלבון נימה ביניים 10. עבודה מאוחרת יותר מדגישה כי SCs לא יכול להיות מוגבלת לאלה לאוו האזורים, והם למעשה מקומיים בכל רחבי המוח כאוכלוסייה במידה רבה שקטה של תאים בחוזקה הקשורים לכלי הדם 11.

התצפיות שSCs מגויסים בתגובה לפציעה מציעה את האפשרות של להיות מסוגלים לנצל את התאים האלה למטרות משובי כדי לסייע בהחלמה מההפרעה ושבץ 12, 13 ניווניות. זה לא בניגוד לתפקיד שתאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק בריפוי של רקמות חיבור, אשר נמצא כתאי perivascular שיש לו את הפוטנציאל להפוך לosteoblasts, כונדרוציטים, ותאי שומן 14. עם זאת, לא יכול להיות שנקטפו NSCs באותו אופן כמו MSCs ממח עצם על ידי שאיפה שגרתית וטכניקות צנטריפוגה שיפוע צפיפות ומנוצל לאחר מכן בטיפולים בתאים מבוססים עצמיים. כתוצאה מכך, מקורות אחרים של תאים, כגון השימוש בNSCs העוברי או מבשרים עצביים הנגזר מEMBתאי גזע ryonic נחקרו בהרחבה במחלות בעלי חיים ומודלי פציעה בדרגות שונות של הצלחה 15 של. טכנולוגיות תא גזע pluripotent מושרה ניצול מקורות תא סומטי להציע עוד שדרת פוטנציאל לייצור טיפולים מבוססי תאים שימושיים טיפולית למגוון רחב של יישומים, להתגבר על הזמינות המוגבלת ודאגות אתיות בנוגע לשימוש בתאים עובריים וברקמות עובריות 16. עם זאת, תרגום קליני של ממצאים אלה הוכיח להיות משימה קשה, כפי שמודגם במאבקים של טיפול במצבים נוירולוגיים שונים עם טיפול מבוסס-SC גישות 17,18, כמו גם במסלול מפותל לאישור רגולטורים. כגישה חלופית, הקדמה של טיפולים תרופתיים ספציפיים יכולה לווסת את מספרי המל"ל ולהקל על התאוששות במודלים של המחלה ושבץ 19 פרקינסון. לא משנה מה האסטרטגיה יכולה להיות, הבנה כיצד לתפעל ביעילות את התאים האלהדורש מערכת נגישה במבחנה.

תרבויות של NSCs יכולות להתבצע גם כתרבויות כוללת, הידוע גם neurospheres, או כmonolayer 8,20. שני הטכניקות היו בשימוש נרחב, המאפשרות את הקמתה של תנאים מוגדרים תרבות, כלומר שימוש בעוריות Growth Factor (EGF) או בסיסי פיברובלסטים Growth Factor (bFGF) כמקור mitogen, המספקים להרחבה של מבשרי multipotent. בעוד תרבויות neurosphere עשויות להיות מתאימות יותר ללימוד יכולת התפשטות משובט של סוג תא מבודד, המערכת הוכח לייצר אוכלוסייה מעורבת של תאים במהלך התרחבות 21. בנוסף, המבנה הסגור של neurospheres עושה מניפולציה תרופתית של התאים לא מעשית, ואת הפרשנות של ההשפעה עשויים להיות גורמים אלה יכול להיות מבולבל בשל microenvironment הוקם בתוך neurosphere עצמו. תרבויות חד שכבתי, לעומת זאת, יכולות להיותמועסק במסכי תפוקה גבוהה של ספריות מולקולה קטנות, המספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את מנגנוני העברת אותות המווסתים את הגדילה והתמיינות SC ופותח את ההזדמנות לגלות תרכובות רומן שמתמקדים אוכלוסיית תא זה.

כתוצאה מכך, את היכולת ליצור reproducibly תרבויות של NSCs המבוגר מאזורים השונים של עניין במוח יכולה לשמש במגוון רחב של יישומי מחקר, החל ממחקרים התפתחותיים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) לחקר גישות רפואת רגנרטיבית רומן . הפרוטוקול המובא כאן ממחיש כיצד לנתח ולהעריך את פוטנציאל ההתמיינות של SCS CNS מבודד מהמוח המכרסם המבוגר.

Protocol

העבודה שומרת על מגילת Helsinski והצהרת בעלי החיים ארוו. בעלי חיים המשמשים לאיסוף רקמות וכל השיטות הרלוונטיות היו במעקב על פי ההנחיות של מתקן בעלי החיים באוניברסיטת דרזדן. בעלי חיים טופלו ושוכנו על פי ההנחיות פדרלי הגרמנית לשימוש וטיפול בבעלי חיים במעבדה, והמחקר אושר על י…

Representative Results

זיהוי האזור של עניין שממנו לקצור תאי גזע עצביים הוא הצעד הראשון הקריטי ויגדיר את משך זמן שנדרש כדי לקבל צלחת ומחוברות של תאים. לדוגמא, SVZ הוא אזור נוירוגנית קלאסי ולכן יש חלקם יחסי גבוה יותר של תאי גזע עצביים. עם זאת, הטכניקה שהוצגה כאן ניתן להשתמש באזורים אחרים לא לעתי…

Discussion

רבים מהשלבים קריטיים לבידוד מוצלח, הרחבה, והתמיינות של תאי גזע עצביים מהמוח הבוגר משותפים במשותף עם טכניקות תרבות תקן רקמות. המטרה לזכור היא שNSCs מבודד מהמוח המבוגר צריך לשמור על כמה שיותר מin vivo המאפיינים שלהם ככל האפשר (איור 2J). לעתים קרובות איזון בין זה?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה (בחלקו) על ידי הלמהולץ ברית ICEMED – ההדמיה וריפוי מחלות מטבוליות הסביבה, באמצעות קרן היוזמה והרשת של הלמהולץ האיגוד, מענק מKroener-Fresenius הקרן אחרת, ומענק מForschungsgemeinschaft דויטשה ( SFB 655: תאים לרקמות).

Materials

6-well tissue culture dishes BD Biosciences 353934
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P-3655

5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C).

Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).

Fibronectin R&D Systems 1030-Fn Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus Corning Life Sciences 430769
DMEM/F-12 Mediatech 10-090-CV See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin Sigma-Aldrich T-2036
Insulin Sigma-Aldrich I-0516
Putrescine Sigma-Aldrich P-5780 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S-5261 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Phosphate Buffered Saline Mediatech 21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) R&D Systems 233-FB Working concentration 20 ng/ml 
Delta4 (Dll4) R&D Systems 1389-D4 Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2) R&D Systems 623-AN Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor Calbiochem 420099 Working concentration 200 nM 
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A-2058
15- and 50-ml Conical tubes Corning Life Sciences 430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
[header]
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15719
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma-Aldrich D-9663
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D-8417 5 mg/ml stock solution in methanol
[header]
Primary Antibody Table
Nestin Chemicon MAB353

Dilution Factor: 1:400

Species: Mouse IgG1

Hes3 Santa Cruz sc-25393

Dilution Factor: 1:100

Species: Rabbit IgG

Sox2 R&D Systems MAB2018 

Dilution Factor: 1:100

Species: Mouse IgG2a

CNPase Chemicon MAB326

Dilution Factor: 1:200

Species: Mouse IgG1

β-tubulin III (TUJ1) R&D Systems MAB1195

Dilution Factor: 1:500

Species: Mouse IgG2a

Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako North America Z0334

Dilution Factor 1:500

Species: Rabbit

[header]
Secondary Antibody Table
Alexa   568 Invitrogen A-21124

Dilution Factor: 1:200

Species: Goat anti Mouse IgG1

Alexa 488 Invitrogen A-21131

Dilution Factor: 1:200

Species: Goat anti Mouse IgG2a

Cy5 Jackson ImmunoResearch 59883

Dilution Factor: 1:200

Species: Goat anti Rabbit

Referências

  1. Cajal, R. Y. . Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , (1899).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).
  3. Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197, 1092-1094 (1977).
  4. Nottebohm, F. Neuronal replacement in adulthood. Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).
  5. Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. Neurogenesis in the neocortex of adult primates. Science. 286, 548-552 (1999).
  6. Kornack, D. R., Rakic, P. Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).
  7. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).
  8. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  9. Luskin, M. B. Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone. Neuron. 11, 173-189 (1993).
  10. Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell. 60, 585-595 (1990).
  11. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).
  12. Jin, K., et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).
  13. Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone. Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).
  14. Caplan, A. I. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. J. Pathol. 217, 318-324 (2009).
  15. Goldman, S. Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system. Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).
  16. Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications. Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).
  17. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, e1000029 (2009).
  18. Lindvall, O., Bjorklund, A. Cell therapeutics in Parkinson’s disease. Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).
  19. Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease. Mo.l Neurobiol. , (2012).
  20. Cattaneo, E., McKay, R. Identifying and manipulating neuronal stem cells. Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).
  21. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
  22. Duarte, A., et al. Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development. Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).
  23. Maisonpierre, P. C., et al. Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science. 277, 55-60 (1997).
  24. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  25. Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture. Neuron. 5, 297-306 (1990).
  26. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  27. Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons. Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).
  28. Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain. J. Neuroinflammation. 6, 39 (2009).
  29. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells. PLoS One. 5, e9414 (2010).
  30. Park, D. M., et al. Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics. Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).
  31. Poser, S. W., Shostak, S., et al. Ch. 5. Cancer Stem Cells – The Cutting. , 89-110 (2011).
  32. Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).
check_url/pt/50880?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Poser, S. W., Androutsellis-Theotokis, A. Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain. J. Vis. Exp. (81), e50880, doi:10.3791/50880 (2013).

View Video