Se describen métodos para la manipulación y análisis de NF-kappa B dependiente de neurogénesis en el hipocampo adulto. Un protocolo detallado se presenta para una prueba de comportamiento circunvolución dentada-dependiente (denominado el patrón espacial de separación-Barnes laberinto) para la investigación de resultado cognitivo en ratones. Esta técnica también debería ayudar a permitir investigaciones en otros parámetros experimentales.
El hipocampo desempeña un papel fundamental en la formación y consolidación de los recuerdos episódicos, y en la orientación espacial. Históricamente, el hipocampo adulto ha sido vista como una región anatómica muy estática del cerebro de los mamíferos. Sin embargo, hallazgos recientes han demostrado que el giro dentado del hipocampo es un área de enorme plasticidad en los adultos, con la participación no sólo de las modificaciones de los circuitos neuronales existentes, sino también la neurogénesis adulta. Esta plasticidad está regulada por redes de transcripción complejas, en la que el factor de transcripción NF-kB desempeña un papel prominente. Para estudiar y manipular la neurogénesis adulta, un modelo de ratón transgénico para la inhibición neuronal del cerebro anterior-específica de la actividad de NF-kappa B puede ser utilizado.
En este estudio, se describen métodos para el análisis de la neurogénesis NF-KB dependiente, incluyendo sus aspectos estructurales, la apoptosis neuronal y la proliferación de células progenitoras, y la significación cognitiva, which se evaluó específicamente a través de un giro dentado (DG) dependiente de la prueba de comportamiento, el patrón espacial de separación-Barnes laberinto (SPS-BM). El protocolo de MSF-BM podría ser simplemente adaptado para su uso con otros modelos de animales transgénicos diseñados para evaluar la influencia de los genes particulares en la neurogénesis del hipocampo adulto. Además, MSF-BM podría ser utilizado en otros entornos experimentales destinados a investigar y la manipulación de aprendizaje DG-dependiente, por ejemplo, el uso de agentes farmacológicos.
Ontológicamente, el hipocampo es una de las estructuras cerebrales anatómicas más antiguos conocidos. Es responsable de diversas tareas complejas, como las funciones clave en la regulación de la memoria a largo plazo, la orientación espacial y la formación y consolidación de la memoria respectiva. Anatómicamente, el hipocampo consiste en capas de células piramidales (estrato piramidal), incluyendo el cuerno de Ammonis (CA1, CA2, CA3, CA4 y) regiones y la circunvolución dentada (dentatus circunvolución), que contiene las células granulares y unos progenitores neuronales dentro de su zona subgranular . Las células granulares proyectan hacia la región CA3 a través de los llamados fibras musgosas (axones de las células granulares).
Hasta finales del siglo pasado, el cerebro de los mamíferos adultos se cree que es un órgano estático que carecen de plasticidad celular y la neurogénesis. Sin embargo, durante las últimas dos décadas, una cantidad creciente de evidencia demuestra claramente la neurogénesis adulta que tiene lugar en al menosdos regiones del cerebro, la zona subventricular (SVZ) y la zona subgranular del hipocampo.
Nuestros estudios previos y los de otros grupos, han demostrado que el factor de transcripción NF-kB es uno de los reguladores moleculares cruciales de la neurogénesis adulta, y que sus resultados de-regulación en los defectos del hipocampo estructurales graves y alteraciones cognitivas 1-6. NF-kappa B es el nombre genérico de un factor de transcripción inducible por compuesto de diferentes combinaciones diméricas de cinco subunidades de unión al ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, y p65 (de RelA), los tres últimos de los cuales tienen dominios de transactivación. Dentro del cerebro, la forma más abundante encontrada en el citoplasma es un heterodímero de p50 y p65, que se mantiene en una forma inactiva por el inhibidor de kappa B (IkB)-proteínas.
Para estudiar y manipular directamente la neurogénesis impulsado por NF-kB, utilizamos modelos de ratones transgénicos para permitir simple inhibición de toda la subun NF-kBsu, específicamente en el cerebro anterior 7 (ver Figura 1). Con este fin, hemos mestizos, las siguientes líneas de ratones transgénicos, IkB / – y -/tTA. El transgénico IkB / – line se generó usando un mutante negativo trans-dominante de NF-kB-inhibidor IκBa (super-represor IκBa-AA1) 8. En contraste con la de tipo salvaje IκBα, IκBα-AA1 tiene dos residuos de serina mutado a alaninas (V32 y V36), que impiden la fosforilación y la degradación proteasómica subsiguiente del inhibidor. Para prosencéfalo neuronal específica la expresión de la IκBa-AA1-transgén, IkB / – ratones fueron cruzadas criados con ratones que albergan una quinasa de calcio-calmodulina dependiente IIα (CAMKIIα)-promotor que puede ser accionado por tetraciclina trans-activador (TTA) 9.
p65 ratones knock-out tienen un fenotipo letal embrionaria, debido a la apoptosis masiva del hígado 10, por lo que el enfoque se muestra aquí ofrece un método elegantepara investigar el papel de NF-kappa B en posnatal y la neurogénesis adulta.
La prueba de comportamiento clásico para estudiar el aprendizaje espacial y la memoria se describe en la década de 1980 por Richard Morris, una prueba conocida como el laberinto de agua de Morris (MWM) 11. En este campo abierto-laberinto de agua, los animales aprenden a escapar del agua opaca a una plataforma de búsqueda basado en la orientación y extra-laberinto señales. Una variante seco de MWM es el denominado laberinto de Barnes (BM) 12. Esta prueba utiliza una placa circular con 20 orificios circulares dispuestos en el borde de un plato, con un agujero definido como una caja de escape, y visuales señales extra-laberinto de orientación. Ambos paradigmas experimentales se basan en el comportamiento de vuelo inducida por una aversión al roedor `s al agua, o espacios abiertos, bien iluminado. Ambas pruebas permiten una investigación de la orientación espacial, y el rendimiento de la memoria relacionados. Aunque el hipocampo desempeña un papel general y esencial en la formación de la memoria espacial, el hipocampo rEGIONES involucrados difieren dependiendo de la prueba aplicada. La memoria a prueba en BM surge de la actividad neuronal entre la corteza enthorinal (CE) y las neuronas piramidales ubicadas en el CA1-región del hipocampo sin una contribución de la DG 13-16. En particular, el clásico BM se basa principalmente en la navegación a través de la vía temporo-amónico monosináptico de CE III de la CA1 a CE V. Es importante destacar que, la DG se crucial que participan en la llamada de reconocimiento de patrón espacial 17, lo que implica no sólo el procesamiento de información visual y espacial, sino también la transformación de las representaciones o recuerdos similares en representaciones diferentes, que no se superponen. Esta tarea requiere un circuito tri-sináptica funcional de la CE a la DG II a CA3 a CA1 y EC VI, que no puede ser probado en el BM 15.
Para hacer frente a estos desafíos, hemos ideado SPS-BM como una prueba de comportamiento para probar específicamente el rendimiento cognitivo gyrus dentado dependiente en coanimales ntrol, y en el modelo de super-represor IkB / TTA consecuencia de la inhibición de NF-kB. Es importante destacar que, en contraste con el MWM o el BM, la MSF-BM puede revelar anomalías de comportamiento sutiles resultantes de deterioro de la neurogénesis. Desde espacial-pattern-separación es estrictamente dependiente de un circuito funcional entre EC II y la DG y CA3 y CA1 y EC VI, esta prueba es muy sensible a los cambios potenciales en la neurogénesis, modificaciones de la vía de las fibras musgosas o alteraciones de la homeostasis del tejido dentro de la DG.
Técnicamente, la puesta a punto de nuestra prueba se basa en el estudio de Clelland et al., En la que el patrón de separación espacial fue probada usando una madera de 8 brazos brazo radial laberinto (RAM) 19. En nuestra configuración modificada, los ocho brazos fueron sustituidos por siete casas de comida amarillas idénticas. En resumen, los métodos que se muestran aquí, incluyendo el análisis de las células que expresan doblecortina (DCX +) en el hipocampo, las proyecciones de fibras musgosas, neuronal de células death y particularmente el SPS-BM presenta aquí, se puede aplicar a las investigaciones de otros modelos de ratones que incorporan los transgenes que tienen un impacto en la neurogénesis adulta. Otras aplicaciones pueden incluir el estudio de los agentes farmacológicos y la medición de su impacto en la separación patrón DG y espacial.
Neurogénesis adulta, y la posibilidad de su manipulación a través de la inhibición de NF-kB en las neuronas, y su reactivación posterior a través de la doxiciclina, ofrece un sistema fascinante para la investigación de las neuronas recién nacidas en el cerebro adulto, así como en la neuronal, y de re-generación . La belleza de este sistema es que la inhibición de la vía de señalización NF-kB en las neuronas no sólo se traduce en cambios en la muerte neuronal celular, la proliferación de progenitores y la…
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a Angela Kralemann-Köhler por su excelente apoyo técnico. El trabajo experimental descrito en este documento se llevó a cabo en nuestro laboratorio y el apoyo de subvenciones del Consejo de Investigación Alemana (DFG) a CK y BK y una subvención del Ministerio alemán de Investigación y Educación (BMBF) de BK.
Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |