في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية
Summary
الهجرة عبر الظهارية العدلات استجابة للعدوى البكتيرية المخاطية يساهم في الإصابة الظهارية والأمراض السريرية. وقد تم تطوير نموذج في المختبر يجمع بين مسببات الأمراض، والعدلات البشرية، وطبقات الخلايا الظهارية البشرية المستقطبة التي تزرع على مرشحات عبرويل لتسهيل التحقيقات نحو كشف الآليات الجزيئية التي تنسق هذه الظاهرة.
Abstract
الأسطح المخاطية بمثابة حواجز واقية ضد الكائنات المسببة للأمراض. يتم تنشيط الاستجابات المناعية الفطرية عند استشعار مسببات الأمراض مما يؤدي إلى تسلل الأنسجة مع الخلايا الالتهابية المهاجرة ، في المقام الأول العدلات. هذه العملية لديها القدرة على أن تكون مدمرة للأنسجة إذا كانت مفرطة أو عقدت في حالة لم تحل. ويمكن استخدام النماذج المستنبطة في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية الفريدة المشاركة في الهجرة العدلية الناجمة عن مسببات الأمراض عبر الظهارية. يوفر هذا النوع من النماذج براعة في التصميم التجريبي مع فرصة للتلاعب الخاضع للرقابة من مسببات الأمراض، حاجز الظهارية، أو العدلات. العدوى المسببة للأمراض من السطح apical من monolayers الظهارية المستقطبة نمت على مرشحات عبرويل نفاذية يحرض القاعدية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لهجرة apical عبر الظهارية من العدلات المطبقة على السطح القاعدي. يوضح النموذج المختبري الموصوف هنا الخطوات المتعددة اللازمة لإثبات هجرة العدلات عبر طبقة أحادية ظهارية رئوية مستقطبة أصيبت بمسببات الأمراض P. aeruginosa (PAO1). يوصف بذر وزراعة الحيوانات المتحولة التي يمكن اختراقها بخلايا ظهارية رئوية مشتقة من الإنسان ، إلى جانب عزل العدلات من الدم البشري الكامل وزراعة PAO1 وK12 E. coli غير المسببة للأمراض (MC1000). وتظهر عملية الهجرة والتحليل الكمي للنيوتروفيل المهاجر بنجاح والتي تمت تعبئتها استجابة للعدوى المسببة للأمراض ببيانات تمثيلية، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية. يمكن معالجة هذا النظام النموذجي في المختبر وتطبيقه على الأسطح المخاطية الأخرى. يمكن أن تكون الاستجابات الالتهابية التي تنطوي على تسلل العدلات المفرط مدمرة للأنسجة المضيفة ويمكن أن تحدث في غياب العدوى المسببة للأمراض. إن الفهم الأفضل للآليات الجزيئية التي تعزز الهجرة عبر الظهارية العدلية من خلال التلاعب التجريبي بنظام الفحص المشترك في المختبر الموصوف هنا لديه إمكانات كبيرة لتحديد أهداف علاجية جديدة لمجموعة من الأمراض المعدية المخاطية وكذلك الالتهابات.
Introduction
السطوح المخاطية بمثابة حواجز مادية ومناعية توفر الحماية من التهديدات الخارجية المنتشرة في البيئة1،2. يمكن اختراق هذا الحاجز الظهاري الواقي عندما تغزو الكائنات المسببة للأمراض2. في حالة الممرض البكتيري ، غالبا ما يحرض هذا اللقاء على عملية التهابية عن طريق تنشيط الجهاز المناعي الفطري مما يؤدي إلى تعبئة سريعة للخلايا الحبيبية المستجيبة الأولى المعروفة باسم العدلات2-4. يتم إنتاج عوامل العلاج الكيميائي التي تسهل تجنيد العدلات جزئيا من قبل الخلايا الظهارية المخاطية التي تسعى لتخليص المضيف من الممرض المخالف2-4. يمكن أن يسبب تسلل العدلات المفرط أو غير المحسوم للسطح الظهاري المخاطي أمراضا كبيرة1،5. هذا هو نتيجة لتلف الأنسجة غير محددة الناجمة عن ترسانة العدلات المضادة للبكتيريا5-7. في مثل هذه الحالات ، تطغى قدرة إزالة البكتيريا من العدلات من خلال تدمير الأنسجة المضيفة أثناء الإهانة المعدية. يمكن أن يؤدي تعطيل وظيفة الحاجز الظهاري الواقي إلى تعزيز تعرض الأنسجة الأساسية للكائنات الحية الدقيقة و / أو السموم ، مما يزيد من تفاقم أمراض الأمراض8،9. ويمكن ملاحظة هذه العواقب في أجهزة متعددة بما في ذلك الرئة والجهاز الهضمي1,5. وعلاوة على ذلك ، تتميز الحالات الالتهابية غير المعدية مثل نوبات الربو الشديدة ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) ومرض التهاب الأمعاء (IBD) بالاختراق المرضي للحاجز الظهاري المخاطي من خلال استجابة العدلاتالمفرطة 4،5،10-12.
عملية معقدة من تجنيد العدلات بعد العدوى المخاطية ينطوي على عدة خطوات مجزأة1,5,13,14. أولا، العدلات يجب أن تخرج عن الدورة الدموية عن طريق سلسلة من التفاعلات بين الخلايا التي تسهل الهجرة عبر البطانية1،13. العدلات المقبل التنقل الفضاء الخلالي القائمة التي تحتوي على مصفوفة خارج الخلية1,14. للوصول إلى تجويف الغشاء المخاطي المصاب ، يجب أن تهاجر العدلات عبر الحاجز الظهاري1،4،5. وغالبا ما يتم التحقيق في هذه الظاهرة متعددة الخطوات المعقدة في المجموع باستخدام نماذج حيوانية في الجسم الحي للعدوى15. هذه النماذج مفيدة لتحديد ضرورة وجود عوامل محددة، مثل chemokines، جزيئات التصاق، أو مسارات الإشارات التي تشارك في العملية الشاملة ولكنها غير كافية إلى حد كبير لحل المساهمات الجزيئية الحاسمة لكل خطوة مجزأة متميزة16. وقد شارك في زراعة نظم المختبر النمذجة عبر البطانية، عبر مصفوفة، أو الهجرة عبر الظهارية من العدلات مفيدة بشكل خاص في هذا الصدد1،14،16،17.
وقد تم تطوير نظام قوي للثنايا المشتركة للتحقق من شفرة الآليات المسؤولة عن الهجرة عبر الظهارية العدلات استجابة للعدوى المسببة للأمراض18-22. هذا النموذج ينطوي على إصابة السطح apical من طبقات الخلايا الظهارية البشرية المستقطبة مع مسببات الأمراض البكتيرية تليها تطبيق العدلات البشرية المعزولة حديثا على سطح basolateral18-22. تهاجر العدلات عبر الحاجز الظهاري استجابة للمنتجات الكيميائية المشتقة من الظهارية التي تفرز بعد العدوى المسببة للأمراض18،21-23. وقد تم استخدام هذا النظام النموذجي باستخدام الثقافات الظهارية المعوية والرئة المعرضة لمسببات الأمراض البكتيرية المناسبة الأنسجة محددة وكشف النقاب عن آليات جزيئية جديدة من المرجح أن تكون مهمة لعملية تجنيد العدلات خلال العدوى المخاطية3,8,19,24-28. قوة هذا النموذج في المختبر الزراعة المشتركة هو أن النهج الاختزالي تمكن المحقق من التلاعب تجريبيا الممرض، حاجز الظهارية، و / أو العدلات في نظام تسيطر عليها بشكل جيد، استنساخ عالية، وغير مكلفة إلى حد ما. يمكن الاستفادة من البصيرة التي تم جمعها من هذا النهج بشكل فعال لإجراء تحليل مركز للأحداث المجزأة أثناء توظيف العدلات باستخدام نماذج عدوى الجسم الحي 22,29,30.
توضح هذه المقالة الخطوات المتعددة اللازمة لنجاح إنشاء هذا النموذج القابل للاستنساخ لاستكشاف الهجرة العدلية الناجمة عن مسببات الأمراض عبر الظهارية. وترد الحواجز الظهارية الرئة المصابة بمسببات الأمراض Pseudomonas aeruginosa في هذه المقالة; ومع ذلك، يمكن استبدال الظهارة الأنسجة الأخرى ومسببات الأمراض مع تعديلات طفيفة. البذر وزراعة طبقات الخلايا الظهارية الرئة المستقطبة على الكولاجين المقلوب المغلفة مرشحات عبرويل نفاذية مفصلة هنا، كما هو نمو المسببة للأمراض P. aeruginosa وعزل العدلات من الدم كله. يتم تقديم كيفية دمج هذه المكونات لمراقبة الهجرة الناجمة عن مسببات الأمراض العدلات عبر الظهارية جنبا إلى جنب مع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة لإنشاء المقايسة القابلة للاستنساخ. وتناقش براعة هذا النهج لدراسة مختلف جوانب الهجرة العدلية الناجمة عن مسببات الأمراض عبر الظهارية مع الإشارة إلى دراسات محددة في الأدبيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هجرة العدلات عبر الأسطح الظهارية المخاطية هي سمة شائعة في أمراض الأمراض بعد العدوى بمسببات الأمراض البكتيرية3. تقدم المنهجية الموصوفة هنا نهجا سريعا ومباشرا لعزل هذا الحدث المنفصل تجريبيا باستخدام خلية بشرية مشتقة من نظام الفحص المشترك في المختبر الذي يقدم نماذج لميزة العملي?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المعاهد القومية للصحة (1 R01 AI095338-01A1).
Materials
| NCl-H292 cells | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) liquid | Invitrogen | 14190-144 | without calcium and magnesium |
| Heat Inactivated Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-147 | 10% added to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC. Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term. |
| Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Sterile, without calcium and magnesium |
| Trypan Blue Solution | Invitrogen | 15250-061. | Stock = 0.4% |
| Collagen, Rat Tail | Invitrogen | A10483-01 | Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Component of 1 M citrate buffer |
| Dextrose anhydrous | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Component of acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Ammonium Chloride | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| HBSS(+) powder | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Key component of HBSS+ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Component of HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Follow vendor instructions to coat glass pipette tips |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Key component of ABTS substrate solution |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Component of ABTS substrate solution |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC. |
| Gelatin Type B | Fisher Scientific | M-12026 | |
| Pseudomonas isolation agar | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Optional, can improve neutrophil purity |
| Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well migration plate | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24-well wash plate | Falcon | 35-1147 | Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse |
| 96-well plate | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Transwell Permeable Supports | Corning Incorporated | #3415 | Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm |
| Petri dish | Falcon | 35-1013 | Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells. |
| 500 ml 0.2 μm filter / flask | Fisher Scientific | 09-740-25A | To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution |
| 5-3/4 in glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | Coat tips with Sigmacote prior to use |
| Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | Curved, Serrated |
| Invertoskop Inverted Microscope | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max Microplate Reader | Molecular Devices | #432789 |
Referências
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
- McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
- Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil’s role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
- Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
- Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
- Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
- Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
- Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
- Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
- Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
- McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
- McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
- Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
- Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
- McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
- Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
- Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
- Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
- McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
- Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
- Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
- Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
- Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
- Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
- Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
- Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
- Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
- Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
- Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
- Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
- Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
- Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).
