במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל
Summary
נדידת חיידקים טרנס-אפיתל נויטרופילים בתגובה לזיהום חיידקי ריר תורמת לפגיעה באפיתל ומחלות קליניות. פותח מודל במבחנה המשלב פתוגן, נויטרופילים אנושיים ושכבות תא אפיתל אנושיות מקוטבות הגדלות על מסנני טרנסוול כדי להקל על חקירות לקראת פענוח המנגנונים המולקולריים המתזמרים תופעה זו.
Abstract
משטחי ריר משמשים כמחסומי הגנה מפני אורגניזמים פתוגניים. תגובות חיסוניות מולדות מופעלות על פי פתוגן חישה המוביל לחדירת רקמות עם תאים דלקתיים נודדים, בעיקר נויטרופילים. תהליך זה יש פוטנציאל להיות הרסני לרקמות אם מוגזם או מוחזק במצב לא פתור. מודלים במבחנה Cocultured ניתן להשתמש כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים הייחודיים המעורבים פתוגן המושרה הגירה נויטרופילית טרנס אפיתל. סוג זה של מודל מספק רב-תכליתיות בעיצוב ניסיוני עם הזדמנות למניפולציה מבוקרת של הפתוגן, מחסום האפיתל או הנויטרופילים. זיהום פתוגניים של פני השטח האפיקליים של מונוליירים אפיתל מקוטבים הגדלים על מסנני טרנסוול חדירים מעוררים בזולטרל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית להגירה טרנס-אפיתל אפיתל של נויטרופילים המוחלים על פני השטח הבזולטרליים. מודל במבחנה המתואר בזאת מדגים את הצעדים המרובים הדרושים להדגמת נדידת נויטרופילים על פני מונולאייר אפיתל ריאות מקוטב שנדבק ב- P. aeruginosa פתוגניים (PAO1). זריעה ו culturing של מהומה חדירה עם תאי אפיתל ריאות נגזר אנושי מתואר, יחד עם בידוד של נויטרופילים מדם אנושי שלם culturing של PAO1 ו K12 E. קולי לאpathogenic (MC1000). תהליך ההגירה והניתוח הכמותי של נויטרופילים שהיגרו בהצלחה וגויסו בתגובה לזיהום פתוגניים מוצגים בנתונים מייצגים, כולל בקרות חיוביות ושליליות. ניתן לתפעל ולהחיל מערכת מודל במבחנה זו על משטחים ריר אחרים. תגובות דלקתיות המערבות חדירה נויטרופילית מוגזמת יכולות להיות הרסניות לרקמות המארחות ויכולות להתרחש בהיעדר זיהומים פתוגניים. הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים המקדמים הגירה טרנס-אפיתל נויטרופילים באמצעות מניפולציה ניסיונית של מערכת מבחני התופת במבחנה המתוארת בזאת יש פוטנציאל משמעותי לזהות מטרות טיפוליות חדשניות למגוון מחלות זיהומיות ריריות כמו גם דלקתיות.
Introduction
משטחים ריר לשמש מחסומים פיזיים ואימונולוגיים מתן הגנה מפני איומים חיצוניים מתפשטים בסביבה1,2. מחסום אפיתל מגן זה יכול להיות בסכנה כאשר אורגניזמים פתוגניים לפלוש2. במקרה של פתוגן חיידקי, מפגש זה לעתים קרובות מעורר תהליך דלקתי על ידי הפעלת המערכת החיסונית המולדת ומפעיל גיוס מהיר של גרנולוציטים המגיב הראשון המכונה נויטרופילים2-4. סוכנים Chemotactic להקל על גיוס נויטרופילים מיוצרים בחלקם על ידי תאי אפיתל הרירית המבקשים לפטור את המארח של הפתוגן הפוגע2-4. חדירת נויטרופילים מוגזמת או לא פתורה של משטח האפיתל הרירית עלולה לגרום לפתולוגיה משמעותית1,5. זוהי תוצאה של נזק לרקמות לא ספציפיות שנגרם על ידי ארסנל נויטרופילים אנטי בקטריאלי5-7. במקרים כאלה, יכולת סיווג חיידקי של נויטרופילים מאפילה על ידי הרס של רקמה מארחת במהלך עלבון זיהומיות. שיבוש של תפקוד מחסום אפיתל מגן יכול להוביל לחשיפה משופרת של הרקמה הבסיסית מיקרואורגניזמים ו / או רעלים, עוד יותר מחריף פתולוגיה המחלה8,9. השלכות אלה ניתן לראות במערכות איברים מרובים כולל הריאה ומערכת העיכול1,5. יתר על כן, מחלות דלקתיות לא מדבקות כגון התקפי אסטמה חמורים, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS), ומחלות מעי דלקתיות (IBD) מסומנים על ידי הפרה פתולוגית של מחסום האפיתל הרירית על ידי תגובה נויטרופילית מוגזמת4,5,10-12.
התהליך המורכב של גיוס נויטרופילים בעקבות זיהום רירי כרוך במספר שלבים ממודרים1,5,13,14. ראשית, נויטרופילים חייבים לצאת מהמחזור באמצעות סדרה של אינטראקציות תא לתא המאפשרות הגירה טרנס אנדותל1,13. נויטרופילים הבאים לנווט בחלל ביניים קיים המכיל מטריצה חוץ תאית1,14. כדי להגיע לומן של רירית נגוע, נויטרופילים חייבים אז לנדוד על פני מחסום האפיתל1,4,5. תופעה מורכבת זו רב צעדים נחקרת לעתים קרובות במצטבר באמצעות מודלים בעלי חיים vivo של זיהום15. מודלים כאלה שימושיים לביסוס הצורך בגורמים ספציפיים, כגון כימוקינים, מולקולות הידבקות או מסלולי איתות המשתתפים בתהליך הכולל אך אינם מתאימים במידה רבה לפתרון תרומות מולקולריות קריטיות עבור כל שלב ממודר מובהק16. Cocultured במערכות במבחנה מידול טרנס אנדותל, טרנס-מטריצה, או הגירה טרנס אפיתל של נויטרופילים היו שימושיים במיוחד בהקשר זה1,14,16,17.
מערכת מבחני קוקולטורה חזקה פותחה לצורך פענוח מנגנונים האחראים להגירה בין אפיתל נויטרופילים בתגובה לזיהום פתוגניים18-22. מודל זה כרוך להדביק את פני השטח apical של שכבות תא אפיתל אנושי מקוטב עם פתוגן חיידקי ואחריו יישום של נויטרופילים אנושיים מבודדים טריים על פני השטח basolateral18-22. נויטרופילים נודדים מעבר למחסום האפיתל בתגובה למוצרים צ’ממוטקטיים שמקורם באפיתל המופרשים בעקבות זיהום פתוגניים18,21-23. מערכת מודל זו הופעלה באמצעות תרביות אפיתל מעיים וריאות שנחשפו לפתוגנים חיידקיים ספציפיים לרקמות המתאימים וחשפה מנגנונים מולקולריים חדשניים שעשויים להיות חשובים לתהליך גיוס הנויטרופילים במהלך זיהום רירי3,8,19,24-28. כוחו של מודל זה במבחנה coculture הוא כי גישה רדוקציוניסטית מאפשרת לחוקר לתפעל באופן ניסיוני את הפתוגן, מחסום אפיתל, ו / או נויטרופילים במערכת מבוקרת היטב, רבייה מאוד, זול למדי. תובנה שנאספה מגישה זו ניתן למנף ביעילות לבצע ניתוח ממוקד של אירועים ממודרים במהלך גיוס נויטרופילים באמצעות מודלים זיהום vivo 22,29,30.
מאמר זה מדגים את השלבים המרובים הדרושים להקמה מוצלחת של מודל זה לשחזור כדי לחקור פתוגן המושרה הגירה טרנס אפיתל נויטרופילים. מחסומי אפיתל ריאות נגועים פתוגן Pseudomonas aeruginosa מוצגים במאמר זה; עם זאת, אפיתליה רקמות אחרות ופתוגנים ניתן להחליף עם שינויים קלים. זריעה ו culturing של שכבות תא אפיתל ריאות מקוטבות על מסנני קולגן מצופים הפוכים מחוררים מפורט בזאת, כמו גם הצמיחה של P. aeruginosa פתוגניים ובידוד של נויטרופילים מדם שלם. כיצד רכיבים אלה משולבים כדי לבחון פתוגן המושרה הגירה טרנס אפיתל נויטרופילים מוצג יחד עם פקדים חיוביים ושליליים מתאימים כדי להקים מבחנה לשחזור. הרבגוניות של גישה זו לבחון היבטים שונים של הגירה נויטרופילית הנגרמת על ידי פתוגן טרנס אפיתל נדון בהתייחסות למחקרים ספציפיים בספרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
נדידת נויטרופילים על פני משטחי אפיתל ריר היא תכונה נפוצה בפתולוגיה של מחלות בעקבות זיהום עם פתוגנים חיידקיים3. המתודולוגיה המתוארת בזאת מציעה גישה מהירה וישירה לבידוד ניסיוני של אירוע דיסקרטי זה באמצעות תא אנושי הנגזר ממערכת מבחני ויטרו-קוקולטורה, המדגימה תכונה של התהליך הדל?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כספית על ידי NIH (1 R01 AI095338-01A1).
Materials
| NCl-H292 cells | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) liquid | Invitrogen | 14190-144 | without calcium and magnesium |
| Heat Inactivated Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-147 | 10% added to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC. Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term. |
| Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Sterile, without calcium and magnesium |
| Trypan Blue Solution | Invitrogen | 15250-061. | Stock = 0.4% |
| Collagen, Rat Tail | Invitrogen | A10483-01 | Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Component of 1 M citrate buffer |
| Dextrose anhydrous | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Component of acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Ammonium Chloride | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| HBSS(+) powder | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Key component of HBSS+ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Component of HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Follow vendor instructions to coat glass pipette tips |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Key component of ABTS substrate solution |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Component of ABTS substrate solution |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC. |
| Gelatin Type B | Fisher Scientific | M-12026 | |
| Pseudomonas isolation agar | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Optional, can improve neutrophil purity |
| Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well migration plate | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24-well wash plate | Falcon | 35-1147 | Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse |
| 96-well plate | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Transwell Permeable Supports | Corning Incorporated | #3415 | Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm |
| Petri dish | Falcon | 35-1013 | Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells. |
| 500 ml 0.2 μm filter / flask | Fisher Scientific | 09-740-25A | To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution |
| 5-3/4 in glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | Coat tips with Sigmacote prior to use |
| Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | Curved, Serrated |
| Invertoskop Inverted Microscope | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max Microplate Reader | Molecular Devices | #432789 |
Referências
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
- McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
- Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil’s role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
- Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
- Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
- Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
- Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
- Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
- Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
- Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
- McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
- McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
- Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
- Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
- McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
- Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
- Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
- Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
- McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
- Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
- Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
- Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
- Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
- Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
- Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
- Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
- Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
- Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
- Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
- Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
- Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
- Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).
