Fosfato de Calcio La transfección de Primaria neuronas del hipocampo
Summary
Precipitación con fosfato de calcio es un método conveniente y económico para la transfección de células cultivadas. Con la optimización, es posible utilizar este método en las células difíciles de transfectar tales como neuronas primarias. A continuación se describe el protocolo detallado para la transfección de fosfato de calcio de las neuronas del hipocampo cocultured con células astroglial.
Abstract
Precipitación con fosfato de calcio es un método conveniente y económico para la transfección de células cultivadas. Con la optimización, es posible utilizar este método en las células difíciles de transfectar tales como neuronas primarias. A continuación se describe el protocolo detallado para la transfección de fosfato de calcio de las neuronas del hipocampo cocultured con células astroglial.
Introduction
Neuronas primarias son uno de los tipos de células más difíciles de transfectar ya que son postmitotic y son muy sensibles a los cambios micro-ambiental. Hay cuatro tipos de uso común de los métodos para la expresión de genes exógenos y los ARN corto horquilla (shRNAs) en estas células 1. Cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas. Por ejemplo, electroporación se realiza generalmente en las neuronas recién aisladas 2, como las células deben ser transferidos en las cubetas para la transfección. Infección por el virus generalmente se puede lograr una eficiencia muy alta 3, pero es y arriesgado para los operadores más intensivos en mano de obra. Muchos reactivos de transfección mediadas por lípidos están disponibles comercialmente, con diversos grados de éxito en las neuronas y diferentes niveles de citotoxicidad.
Transfección con fosfato de calcio representa un método conveniente y económico para la introducción de genes extraños en las neuronas. El método fue utilizado por primera vez para introducir ADN adenovirus en cel mamíferosls por Graham y Van Der Eb (1973) 4. La transfección se realizó mediante la mezcla de cloruro de calcio con el ADN recombinante en un tampón de fosfato. Esto permite la formación de fosfato de ADN / calcio precipitados que, cuando se deja caer poco a poco sobre una monocapa de células, se adhieren a la superficie celular, son absorbidos por endocitosis y finalmente entrar en el núcleo 5. Este proceso daría lugar a la expresión de genes extraños introducidos en la célula diana. Eficiencias típicas de calcio gama transfección con fosfato de entre 0,5-5% 6-8. Sin embargo, con la optimización cuidadosa y ejecución consistente del protocolo experimental, es posible llegar a una eficacia de transfección de casi el 50%. Aquí describimos nuestro protocolo detallado para la transfección de fosfato de calcio de las neuronas del hipocampo primarias, que se co-cultivaron con células astroglial en un formato sándwich 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios parámetros clave que deben ser cuidadosamente controlada para transfecciones consistentemente exitosos 10,11. El parámetro más crítico para la transfección de fosfato de calcio es el valor de pH de 2x HBS, que en nuestras manos por lo general varía entre 7.10 hasta 7.15. Se recomienda hacer tres lotes de acciones con valores de pH en incrementos de 0.05 para dar cuenta de la diferencia entre los medidores de pH. Alternativamente, el kit de transfección de mamíferos Clontech proporciona 2x H…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el NIH subvención NS065183 y los fondos de puesta en marcha de la Escuela de Medicina Robert Wood Johnson de Rutgers.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
Referências
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