JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Kültürleme ve bakımı<em> Clostridium difficile</em> Bir Anaerobik Çevre

Published: September 14, 2013
doi:
10.3791/50787
, ,
1Department of Microbiology and Immunology,Emory University School of Medicine

Summary

Clostridium difficile sıkı anaerob ve antibiyotik ilişkili ishal (AAD) neden olan bir patojen bakteridir. Burada, izole edilmesi ve kültür C muhafaza edilmesi için yöntemler difficile bitkisel hücreleri ve sporlar açıklanmıştır. Bu teknikler optimum C için uygun koşulları sağlamak için düzenli bakım gerektirir, bir anaerobik odasını gerektiren difficile ekimi.

Abstract

Clostridium difficile antibiyotik ilişkili ishal (AAD) için öncelikle sorumlu ve önemli bir nozokomiyal patojen olan bir Gram-pozitif, anaerobik, sporogenic bakteridir. C. difficile izole etmek ve geliştirmek için çok zordur ve çevre oksijen düşük seviyelerde bile son derece duyarlıdır. Burada, C izole edilmesi için yöntemler dışkı örnekleri difficile ve daha sonra kültür C. , uzun süreli depolama için gliserol stoklarının hazırlanması için difficile sunulmaktadır. Mikroskopi ve hayvan çalışmaları dahil olmak üzere alt çeşitli uygulamalar için laboratuarda spor stoklarının hazırlanması ve numaralandırma için teknikler de tarif edilmiştir. Bu teknikler en iyi C için uygun koşulları temin etmek üzere tutarlı oksijensiz bir ortamın oksijensiz odası, gerektirecek difficile büyüme. Biz ca olmadan odasının içinde ve dışında malzeme aktarımı için protokolleri sağlamakverimli ve tutarlı C için uygun anaerobik ortam sürdürmek için gerekli düzenli bakım önerileriyle birlikte önemli oksijen kirlenmeyi kullanarak difficile ekimi.

Introduction

Clostridium difficile bir zorunlu anaerob ve insanlarda ve hayvanlarda bir potansiyel olarak ölümcül bir gastrointestinal patojen olan bir Gram-pozitif, spor oluşturucu bakteridir. Başlangıçta yenidoğanlarda 1, C. dışkısında bulunan bir ortakçı organizma olarak 1935 yılında açıklanan difficile daha sonra antibiyotik tedavisi ile ilişkili 2 psödomembranöz kolit neden olan ajan olduğu gösterilmiştir. C'yi difficile enfeksiyonları (CDI), genellikle C için bir niş oluşturmak, normal kolonik floranın bozulmasına sonuçları antibiyotik tedavisi ile takip edilir difficile 2 gelişmek için. C. difficile fekal-oral yolla bir atıl sporun olarak iletilir ve daha sonra çeşitli toksinleri üreten ve ciddi hastalık ve kolit 3 neden yeteneğine vejetatif hücreleri üreten, gastrointestinal sistem içinde filizlenir edilir. CDI, genellikle geleneksel tedavilere ve bu 'de refrakterFections sık sık 4. tekrarlamış edilir. Sonuç olarak, CDI Amerika Birleşik Devletleri 5-7 sağlık maliyetlerinde kadar 4800000000 $ sorumludur.

C. difficile ortamında oksijen düşük seviyelerde bile çok hassastır. C. için difficile ortamda hayatta kalmaya ve verimli bir konağa ana bulaşabilir, metabolik olarak aktif olmayan sporun oluşumu kritik 8'dir. Çünkü C laboratuvar bakım ve manipülasyon difficile Bu teknikler, bir anaerobik odanın kullanımını gerektiren, kontrollü, oksijensiz bir ortam gerektirir. Anaerobik bölmelerin kullanılması artan geri kazanım ve zorunlu anaeroblar 9-11 izolasyonu ile sonuçlandı ve anaerobik atmosferde gerçekleştirilebilir moleküler teknikler sağladı.

C ek olarak, difficile, burada açıklanan anaerobik odası kullanımı ve bakımı uygulanabilirBu diğer Clostridial türleri (örneğin, C. perfringens), diğer mide-bağırsak türler (örneğin, Bacteroides türleri, 12) ve periodontal patojenlere (örneğin, Peptostreptococcus türlerinin 13) gibi diğer zorunlu anaeroblar için.

Protocol

Not: C, difficile gastrointestinal hastalığa neden olabilir, insan ve hayvan patojendir. C ile ilgili deneyler difficile uygun biyogüvenlik önlemleri (BSL2) ile yapılmalıdır. 1.. Anaerobik Odası Kullanım ve Bakım C. difficile sıkı bir anaerob ve atmosferdeki oksijenin düşük konsantrasyonlarda bile son derece duyarlıdır. Bu nedenle, kontrol, anaerobik ortam başarılı manipülasyon için gereklidir. Anaerobik oda…

Representative Results

C. bir örneği BHIS ve Columbia anaerobik koyun kan agar ortamı üzerinde büyütülmüş difficile, Şekil 2'de görülebilir. C. difficile düz ve hem de medya üzerinde belirgin bir buzlu cam görünümü sahip düzensiz koloniler oluşturur. Burada, C'lik bir eritromisin duyarlı klinik izolat difficile, 630E 30, 37 ° C '(Şekil 2A), 24 saat boyunca, BHIS ağar, bir zenginleştirilmiş ve seçici olmayan ortam ü…

Discussion

Burada açıklanan yöntemler, C, basit ve hızlı bir iyileşme sağlar insan, fare ve hamster, hem de C, uzun süreli depolama içeren dışkı örnekleri, çeşitli difficile gliserol veya spor hisse senetleri gibi difficile. C. difficile yetiştirmek için zor bir organizma olabilir, ancak dikkatli bir anaerobik ortam bakım ve aseptik tekniklerin uygulanması güçlü büyüme ve kirlenme bir azalma sağlayabilir.

Anaerobik odaları: Hususlar ve Bakım <…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz nazik anaerobik odasının fotoğraflarını sağlamak için Coy Laboratuvarları teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık hibe DK087763 (SMM) ve STEP / HHMI Müfredat Geliştirme Bursu (ANE) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Proteose Peptone no. 2 BD 212120
Na2HPO4 Fisher S373
KH2PO4 Fisher BP362
NaCl Fisher S27
MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
ᴅ-Fructose Fisher L96
Sodium taurocholate Sigma T4009
ᴅ-cycloserine Sigma C6880
Cefoxitin Fluka C4786
Brain heart infusion medium BD 237300
Proteose Peptone BD 211684
(NH4)2SO4 Sigma A5132
Tris base Fisher BP152
Agar BD 214010
L-cysteine Sigma C7755
BactoPeptone BD 211684
Columbian sheep blood agar Fisher L21928
NaCl Fisher S27
KCl Fisher P217
Glycerol Fisher BP2291
Sterile inoculating loops Fisher 22363596
Sterile swabs Fisher 1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar

Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

After autoclaving, add:
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

BHIS Medium

Brain heart infusion 37 g
Yeast extract 5 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):

3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

SMC Sporulation Medium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):
3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3.5 g
Brain heart infusion 11.1 g
Yeast extract 1.5 g
(NH4)2SO4 0.7 g
Tris base 1.06 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

Blood agar

The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

1X Phosphate buffered saline (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hall, I. C., O’Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants – With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
  2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis – Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
  3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
  4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, 32-42 (2008).
  5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
  6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
  7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
  8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
  9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
  10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
  11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene, ., Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
  12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
  13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
  14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
  15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
  17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
  18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
  19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
  20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
  21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
  22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
  23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
  24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
  25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
  26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
  27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
  28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
  29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
  30. O’Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
  31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
  32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
  33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
  34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
  35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

Tags

Clostridium DifficileAnaerobic EnvironmentAnaerobic ChamberFecal SamplesIsolationCultivationGlycerol StocksSpore StocksAntibiotic-associated DiarrheaNosocomial Pathogen

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image