Microfluidic Reacción en el chip de captura-cicloadición para inmovilizar reversiblemente pequeñas moléculas o estructuras de múltiples componentes para aplicaciones de biosensores
Summary
Se presenta un método para la rápida inmovilización reversible de moléculas pequeñas y las asambleas de nanopartículas funcionalizadas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) los estudios, utilizando secuencial en el chip de captura química cicloadición bioorthogonal y anticuerpo-antígeno.
Abstract
Los métodos para la inmovilización de superficie rápida de pequeñas moléculas bioactivas con el control sobre la orientación y densidad de inmovilización son altamente deseables para aplicaciones de biosensores y de microarrays. En este estudio, utilizamos una bioorthogonal altamente eficiente covalente [4 +2] reacción de cicloadición entre trans-cicloocteno (TCO) y 1,2,4,5-tetrazina (Tz) para permitir la inmovilización de microfluidos de moléculas derivatizadas-Tz TCO / . Supervisamos el proceso en tiempo real bajo condiciones de flujo continuo utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR). Para permitir la inmovilización reversible y ampliar la gama experimental de la superficie del sensor, se combinan un componente de captura de antígeno-anticuerpo no covalente con la reacción de cicloadición. Al presentar alternativamente restos TCO o Tz a la superficie del sensor, múltiples procesos de captura-cicloadición son ahora posibles en una superficie del sensor de montaje y de interacción on-chip de estudios de una variedad de estructuras de componentes múltiples. Nos illustrate este método con dos experimentos diferentes de inmovilización en un chip biosensor; una molécula pequeña, AP1497 que se une la proteína de unión a FK506-12 (FKBP12), y la misma molécula pequeña como parte de una nanopartícula in situ-funcionalizado inmovilizado y en.
Introduction
Reacciones de conjugación eficientes son herramientas valiosas para la fijación de moléculas bioactivas a las superficies para una variedad de aplicaciones de la biotecnología. Recientemente, el bioorthogonal muy rápido [4 2] de reacción de cicloadición entre trans-cicloocteno (TCO) y 1,2,4,5-tetrazina (Tz) se ha utilizado para etiquetar superficies de las células, estructuras subcelulares, anticuerpos y nanopartículas 1. – 7 Aquí, utilizamos el [4 +2] reacción de cicloadición en combinación con la captura de antígeno / anticuerpo (GST / anti-GST) para reversible la síntesis en el chip de estructuras de componentes múltiples para resonancia de plasmones superficiales (SPR) análisis de la interacción y monitoreamos la proceso en tiempo real (Figura 1). 8,9 En particular, la estrategia de captura-cicloadición permite la regeneración de la superficie utilizando un protocolo establecido. 8 Como consecuencia de ello, el conjunto de superficies de sensor estables con control sobre la orientación y densidad de ligando para la variedad de nuevo ensayo formatos es ahora posible. Usoesta estrategia demostramos la inmovilización de pequeñas moléculas derivatizadas-Tz TCO / y caracterizar los tipos de cicloadición en una variedad de condiciones de tampón. Elegimos la conocida interacción entre FKBP12 y un AP1497 molécula que se une a FKBP12 10-12 como un ejemplo para verificar que la estrategia de captura-cicloadición conserva la capacidad de la molécula pequeña para interactuar con su objetivo cuando ya sea directamente unido a los antígenos inmovilizados de GST o nanopartículas inmovilizadas (NPS).
Este método ofrece varias ventajas. En primer lugar, la inmovilización reversible de moléculas pequeñas en chips sensores es ahora posible. En segundo lugar, TCO / Tz inmovilización de moléculas pequeñas también permite estudios de interacción de marca libre que revierten la orientación de los estudios SPR canónicas, y puede proporcionar una visión complementaria de una interacción de unión. En tercer lugar, este método permite la síntesis de microfluidos de nanopartículas dirigidas, y la evaluación inmediata de su bindinpropiedades g. Esto promete mejorar la eficiencia de la evaluación o prueba de nanopartículas específicas, y también disminuir las cantidades de nanopartículas requeridos. 13-15 En cuarto lugar, este enfoque puede medir la cinética de reacción de reacciones de cicloadición bioorthogonal en tiempo real en un flujo continuo. Finalmente, la inmovilización química TCO / Tz es robusto en presencia de suero. Tomados en conjunto, podemos anticipar que este enfoque versátil ampliamente facilitar la construcción de superficies de sensor estables para una amplia variedad de estudios de microfluidos con relevancia para in vitro y pt aplicaciones celulares in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de captura-cicloadición aquí descrito permite una rápida inmovilización reversible de las nanopartículas modificadas y pequeñas moléculas para la interacción basada en el chip sin etiquetas y los estudios cinéticos. El protocolo de inmovilización se puede realizar en minutos que requieren <10 M concentraciones de ligandos de molécula pequeña. Mediante la modulación de la concentración de ligando y densidades de inmovilización de tiempo de contacto puede estar estrechamente controlado. Nuestr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos la financiación de los NIH (NHLBI Contrato No. HHSN268201000044C a RW, SH y SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
Referências
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
