Medlemmer av Burkholderia slekten er patogener av klinisk betydning. Vi beskriver en fremgangsmåte for total bakterieprotein utvinning, ved hjelp av mekaniske forstyrrelser, og 2-D-gel-elektroforese etterfølgende proteomikk analyse.
Undersøkelsen av de intracellulære protein-nivåer i bakterielle arter er av betydning for å forstå de patogene mekanismer av sykdommer forårsaket av slike organismer. Her beskriver vi en fremgangsmåte for protein-fjerning fra Burkholderia arter basert på mekanisk lysis ved hjelp av glasskuler i nærvær av etylendiamin-tetraeddiksyre og fenylmethyl-sulfonylfluorid i fosfatbufret saltvann. Denne metoden kan bli brukt for forskjellige Burkholderia arter, for forskjellige vekstbetingelser, og det er sannsynlig egnet for bruk i proteomic studier av andre bakterier. Etter protein ekstraksjon, er en to-dimensjonal (2-D) gelelektroforese proteomikk teknikk som er beskrevet for å studere globale endringer i proteomes av disse organismene. Denne metoden består av separering av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimensjon, etterfulgt av separering på basis av molekylvektved akrylamid gel elektroforese i den andre dimensjonen. Visualisering av separerte proteinene blir utført ved sølvfarging.
Slekten Burkholderia omfatter mer enn 62 arter, Gram-negative organismer ble isolert fra en rekke nisjer, og den er delt i to hoved klynger 1,2. Den første klyngen omfatter mennesker, dyr og phytotrophic organismer, og de fleste studier har fokusert på de sykdomsfremkallende arter av denne gruppen på grunn av deres kliniske betydning. De mest patogene medlemmer er B. pseudomallei og B. mallei (som forårsaker melioidosis og glanders henholdsvis) 3,4 og opportunistiske patogener (de 17 definerte arter av Burkholderia cepacia kompleks, BCC) 5, som forårsaker sykdom hos cystisk fibrose (CF) og kronisk granulomatøs sykdom (CGD) en. Den andre klyngen, med mer enn 30 ikke-patogene arter, omfatter bakterier assosiert med planter eller med miljøet, og anses potensielt fordelaktig for verten 2..
Tallrike komplikasjoner dukker frOM bakteriell infeksjon med den patogene medlemmer av Burkholderia slekten, slik som overføring av organismen mellom pasienter, spredning av sykdommen og behandlingssvikt på grunn av den indre eller ervervet resistens mot antibiotika gjør vanskelig å utrydde i de fleste av tilfellene 6-9. Derfor få en klarere forståelse av grunnlaget for etablering av bakteriell infeksjon er viktig for behandling av sykdommer forårsaket av slike organismer. For å få innsikt i etablering av infeksjon, er omfattende undersøkelser på de bakterielle komponenter assosiert med patogenesen nødvendig. Studier som fokuserer på proteomikk analyser av Burkholderia organismer ved hjelp av proteomikk tilnærminger beskrevet proteiner som har vært innblandet i bakteriell patogenesen samt endringer i deres proteom profiler 10-16.
Protein utvinning metoder ved hjelp av ultralydbehandling og fryse-tint sykluser i lysis buffer som inneholder høy konsentration av urea, har tiourinstoff i kombinasjon med vaskemiddel og ampholytes blitt anvendt i Burkholderia proteomikk studier 10-13. Selv urinstoff er ganske effektiv for proteindenaturering, kan den etablere en likevekt i vandig oppløsning med ammonium-isocyanat, som kan reagere med amino-syregrupper, for derved å danne gjenstander (karbamylering reaksjon) 17. Derfor anbefales det å inkludere bærer ampholytes, som fungerer som cyanat passiveringsmidler og unngå temperaturer høyere enn 37 ° C 17. Videre, for å forhindre en hvilken som helst kjemisk interferens av lysis buffer med protein kvantifisering, den samme lyseringsbuffer kan anvendes til å generere standardkurven, slik at prøvene og standardene har samme bakgrunn 10.. Andre metoder involverer bruken av alkaliske buffere og vaskemidler med varme inkubasjonsperioder 17,18, men disse betingelser kan indusere endringer i proteomet og enkelte vaskemidler er ikke kompatible med proteomics søknad med mindre senere fjernings vaskemiddel trinn er inkludert 17,18.
Etter tilfredsstillende ekstraksjon og kvantifisering kan global protein ekspresjon av hvert enkelt protein bli studert ved hjelp proteomic tilnærminger som to-dimensjonal (2-D) gelelektroforese. Denne teknikken ble først beskrevet av O'Farell 19 og består i separasjonen av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimensjon, og deretter i henhold til deres molekylvekt ved akrylamid gel elektroforese i den andre dimensjonen. På grunn av dets oppløsning og sensitivitet, er denne teknikken et kraftig verktøy for analyse og påvisning av proteiner fra komplekse biologiske kilder 19,20. Denne separasjonsteknikk er for tiden tilgjengelig i protein-sentriske tilnærminger med den store fordelen av å løse protein isoforms forårsaket av post-transcriptional modifikasjoner eller proteolytisk prosessering. Kvantitative endringerkan påvises ved å sammenligne intensiteten av den tilsvarende sted etter farging av gelen 20.. Imidlertid er denne teknikk ikke er egnet for identifisering av meget store proteiner, membranproteiner, ekstremt enkel og sure eller hydrofobe proteiner, og er en noe arbeidskrevende og tidskrevende teknikk 20.. Nye peptid-sentriske tilnærminger (ikke gel-basert) som er mer robust og objektiv blir tilgjengelige og kan benyttes for kvantitativ sammenligning av differensial stabile isotoper for merking av metoder som cystein merking av isotop-kodet affinitet merking (ICAT) 21, og aminogruppen merking av isotopen tagging for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) 22. Bruken av en enkelt proteomikk teknikk kan gi utilstrekkelig informasjon, og derfor bruken av to komplementære proteomic tilnærminger er nødvendig for de fleste fullstendig å vurdere endringer i proteom. Ikke desto mindre er 2-D-gel-elektroforese utbredt og kan rutinemessig anvendes for kvantitative uttrykket av flere proteiner i ulike organismer.
Her beskriver vi en hel-celle protein utvinning og 2-D gel elektroforese prosedyrer for Burkholderia arter som ble tilpasset og optimalisert fra GE Healthcare 2-D elektroforese Prinsipper og metoder håndbok 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Proteinet ekstraksjon ble utført ved hjelp av en limstreng beater med glasskuler i nærvær av PBS inneholdende 5 mM EDTA (etylendiamin-tetraeddiksyre), 1 mM PMSF (fenylmethyl-sulfonylfluorid). Denne prosedyren tillater kvantifisering av proteiner med minimal degradering og er amendable for proteomikk tilnærminger som tidligere rapportert 15,23,24. 2-D-gel-elektroforese ble utført ved å bruke 24 cm lang immobilisert pH 4-7 gradient og proteiner ble separert i henhold til deres isoelektriske punkt. Deretter proteiner ble separert i henhold til deres Molecmeringen vekt ved SDS-polyakrylamid-gel. I tillegg har vi beskrevet en sølvfargemetoden for visualisering av stikk proteiner, og en sølvfarge metode som er kompatibel for massespektrometri-analyse. Sammen disse prosedyrene kan tillate identifikasjon av viktige proteiner fra Burkholderia arter som kan være involvert i patogenesen.
En fremgangsmåte for proteiner Preparatet er beskrevet som kan trekke ut mesteparten av Burkholderia proteiner med god reproduserbarhet. Dette er demonstrert ved å skaffe den samme proteinprofilen fra to uavhengige preparater utført på forskjellige dager ved bruk av samme bakteriekultur dyrket i LB-eller YEM buljong, som vist i figur 1. Utvinning var effektiv for bakterier dyrkes i flytende medier, men vi har ikke testet denne metoden for bakterier dyrket på platene. Denne metoden ble ogs?…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en studieplass fra The University of British Columbia (til BV) og tilskudd fra Cystisk Fibrose Canada og kanadiske Institutes of Health Research (til DPS). Vi takker Jacqueline Chung for den første utarbeidelse av protokoller.
Reagents | |||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
Tris Base | EMD | 9230 | |
Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
Equipment | |||
JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |