哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

細菌やそれらが存在するホスト間の動的相互作用と共進化があります。細菌が付着小器官、分泌系、および/または宿主食細胞および非貪食細胞のそれらの生産的な感染を可能にする毒素を産生する能力を進化させてきた。細菌は、宿主免疫系の認識と抗菌活性と競合しなければならない。宿主の免疫系は、物理的および化学的障壁、免疫細胞、補体系、及び体液性免疫の他の成分を含む、先天性および適応性の成分から構成されている。多くの細菌は、多層宿主免疫応答による殺傷およびクリアランスを受けやすいが、いくつかの病原性および日和見細菌は、種々の宿主細胞に感染し、宿主免疫応答¹によるクリアランスを破壊するメカニズムを進化させてきた。 淋菌は、細菌病原体の一例であるそれは非常に、そのヒト宿主に固執するようになっている。N。淋菌は、容易に尿生殖路、咽頭、結膜、および直腸の粘膜上皮細胞の管の表面にコロニーを形成。植民地化は、粘膜部位に好中球の豊富な採用をトリガします。好中球は、微生物を殺す抗菌様々なプロセスを持っている専門的な食細胞であるが、N。淋菌は、好中球^2-5の存在下で生存することが可能である。このようなNとしてどのように細菌性病原体の理解淋菌覆す、抑制し、最終的には、通常敵対ホスト環境で生き残るために免疫応答をハイジャックは、感染症と闘うための新たな治療法の開発に不可欠である。

多くの場合、宿主細胞内での細菌の生存を調査するために使用される実験プロトコルは、コロニーカウントアッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、電子顕微鏡法が挙げられる。コロニー数のアッセイでは、感染した細胞の集団は、WHの洗剤で、例えば（溶解されているICH細菌は細菌を遊離させるために）抵抗性である。溶解物を希釈し、寒天ベースの培地上にプレートし、溶解物中のコロニー形成単位を、各時点および/または実験条件について列挙されている。このアプローチは、全体の細菌集団の生存を報告したが、細胞内と細胞外の生存を区別することはできない。コロニーカウントアッセイの変形、ゲンタマイシン保護アッセイは、具体的には真核生物の原形質膜^6を通過する抗生物質ゲンタマイシンできないことに基づいて、細胞内の細菌の生存率を測定する。しかし、このアッセイは、ゲンタマイシン（または同様に、真核生物膜非透過性である別の抗生物質）と内部の細菌へのアクセス権を持っている抗生物質のことができないことによって殺傷に対して感受性である細菌に依存している。したがって、ゲンタマイシン保護アッセイは、すべての細菌種の検査のために有効であるか否よい高度における細菌の生存率を調べると好中球などのピノサイトーシス細胞。 （細菌が凝集体又は異なって、個々の細菌細胞から振る舞う微小コロニーを形成している場合など ）これらのアプローチのいずれも、細胞内局在や個々の細菌の他の動作を明らかにする。個々の外部および内部の細菌の生存率を調べるための別のアプローチは、頻繁に使用される薄切片を透過型電子顕微鏡（TEM）である。それはさらに、亜細胞マーカーに対する金結合抗体を用いて免疫電子顕微鏡によって調査することができる宿主細胞（ 例えばファゴソーム、細胞質、オートファゴソーム）、細菌の位置に関する情報を提供することができるという点で、このアプローチは有利で ​​ある。しかし、電子顕微鏡では、細菌の生存能力を評価することを特に区別されません。埋め込まれた切片は、酢酸ウラニル、クエン酸鉛、または他の電子密度試薬で染色し、電子顕微鏡によって画像化されると、電子密度の高い細菌が生存可能であり、電気考えられているTRONルーセント生育不能^7,8。しかし、この仮定はひどく混乱膜や細胞質を欠いたとだけ死菌ので、電子·ルーセントが表示され、細菌の生存能力を過大評価。さらに、いくつかの細菌種は、それが困難な生存率を決定すること、それらの成長段階に応じて、電子密度の範囲を表示することができる。

代替として、またはこれらの広く使用されている方法に加えて、ここでは、宿主細胞によって内在化に取り付けられた細菌の生存を評価するための細菌の生存率を示す蛍光染料の使用のためのプロトコルおよび理論的根拠を提供する。細胞外の細菌を同定するために、感染細胞を、最初のそのようなレクチンまたは細菌特異的抗体などの蛍光試薬にさらされる。感染した細胞は、その後、透過処理し、細菌の生存のための代理として、劣化した膜対そのままで細菌に差動的にアクセス可能なDNA特異的染料にさらされている。最初のP INヨウ化プロピジウムは、膜を侵害しているため、生育不能と考えられているものの細菌のみがアクセスされている間rotocol、膜透過性色素SYTO9は、全細菌集団を同定する。ヨウ化とSYTO9は、バイオフィルム中の細菌の生存能力を評価する非病原性細菌から病原性差別、そして実行可能な水性菌^9月12日を列挙するために使用されている。 SYTOXグリーン生育不能人口のみがアクセスされているときに2番目のプロトコルでは、4 '、6'-ジアミジノ-2 – フェニルインドール（DAPI）は、総菌数を識別します。これらの生存度色素対は、細菌の細胞内局在を定義する、例えば、目的のタンパク質に関連して各細菌の位置を決定するために、免疫蛍光法と組み合わせることができる。これらのアッセイの使用は、宿主細胞の感染時に細菌殺傷または生存につながる相互作用に重要な洞察を提供します。この資料に記載されているプロトコルは、生存率を評価した好中球ファゴソーム^5,13,14の異なる集団に含めた初代ヒト好中球、および内部で接続されている淋菌 。しかしながら、これらのプロトコルは、プロ食細胞、非専門食細胞、および原生動物で^15-24グラム陽性およびグラム陰性細菌の生存率を評価するために適用することができる。