Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

Существует динамическое взаимодействие и коэволюция между бактериями и хозяев, в которых они проживают. Бактерии развивались приверженности органеллы, секреции системы, и / или способность производить токсины, которые позволяют их производственного заражение хозяина фагоцитарную и не-фагоцитов. Бактерии также должна будет бороться с признанием и антимикробных деятельности иммунной системы хозяина. Хозяин иммунная система состоит из врожденного и приобретенного компонентов, включая физических и химических барьеров, иммунных клеток, системы комплемента, и других компонентов гуморального иммунитета. Хотя многие бактерии чувствительны к гибели и очистки с помощью многослойной иммунного ответа, некоторые патогенные и условно-патогенные бактерии развивались механизмы заражают различные клетки-хозяева и саботировать зазор иммунного ответа ^1. Гонококков является одним из примеров бактериальным патогеном что в высшей степени приспособлен упорствовать в своем человеческого организма. N. гонореи легко колонизирует просвета поверхности эпителиальных клеток слизистых урогенитального тракта, глотки, конъюнктивы, и прямой кишки. Колонизация вызывает обильное вербовку нейтрофилов в местах слизистой. Нейтрофилов профессиональные фагоциты, которые обладают различными антимикробными процессов, чтобы убить микроорганизмы, однако Н. гонореи способен выживать в присутствии нейтрофилов ^2-5. Принципы действия бактериальных патогенов, таких как N. гонореи подорвать, подавить и захватить иммунный ответ, в конечном счете выжить в обычно враждебной среде принимающих имеет решающее значение для разработки новых методов лечения для борьбы с инфекционными заболеваниями.

Экспериментальные протоколы часто используются, чтобы исследовать выживаемость бактерий в клетках-хозяевах включают количество колоний анализы, анализы, гентамицин защиты и электронной микроскопии. В подсчета колоний анализов, население зараженных клеток лизируется (например, с помощью моющего средства для WHич бактерии устойчивы), чтобы освободить бактерии. Лизаты разбавляют и высевают на агар на основе информации, а колониеобразующих единиц в лизатах перечислены для каждой временной точки и / или экспериментальных условиях. Этот подход сообщает жизнеспособность всей популяции бактерий, но не способны дифференцироваться между внутриклеточным и внеклеточным выживания. Вариация на количество колоний анализа, анализа защиты гентамицин, специально измеряет внутриклеточный выживаемость бактерий, основанный на неспособности к антибиотикам гентамицин, чтобы пересечь эукариотической мембрану плазмы ^6. Тем не менее, этот анализ зависит от бактерий, являющихся восприимчивыми к гентамицину погибли на (или другого антибиотика, который аналогичным образом эукариотической мембраной impermeant) и неспособности антибиотика, чтобы иметь доступ к внутренним бактерий. Таким образом, защита гентамицин анализ не может быть эффективным для изучения всех видов бактерий или при рассмотрении выживаемость бактерий в сильнопиноцитозные клетки, такие как нейтрофилы. Ни один из этих подходов раскрывает внутриклеточную локализацию или другой поведение отдельных бактерий (например, если бактерии образуют агрегаты или микроколонии, которые ведут себя иначе, чем отдельных бактериальных клеток). Другим часто используемым подходом для изучения жизнеспособности отдельных внешних и внутренних бактерий тонкого раздел просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Этот подход имеет то преимущество, что она может предоставить информацию о местоположении бактерий в клетках-хозяевах (например Фагосомы, цитоплазма, аутофагосом), которые могут быть дополнительно исследованном иммуноэлектронной микроскопии с золотом в сочетании антител против внутриклеточных маркеров. Тем не менее, электронная микроскопия не особенно чувствительны при оценке бактериальной жизнеспособности. Когда срезы окрашивали уранилацетатом, цитратом свинца или других электронно-плотные реагенты и отображаемого с помощью электронной микроскопии, электронно-плотные бактерии считаются жизнеспособными и электроэлектрон-Lucent нежизнеспособным ^7,8. Однако это предположение переоценивает бактериальную жизнеспособность, так как только те мертвых бактерий с сильно разрушенных мембран и лишены цитоплазмы появляются электронно-Lucent. Кроме того, некоторые виды бактерий могут вывести диапазон плотности электронов в зависимости от их стадии роста, что делает его трудно определить жизнеспособность.

В качестве альтернативы или в дополнение к этим широко используемых методов, здесь мы предлагаем протоколы и обоснование для использования флуоресцентных красителей, которые указывают бактериальной жизнеспособности для оценки выживаемости бактерий, прикрепленных к и усвоены клеток-хозяев. Для идентификации внеклеточных бактерий, инфицированные клетки сначала подвергают воздействию флуоресцентного реагента, такого как лектина или бактерии-специфические антитела. Инфицированные клетки затем проницаемыми и подвергаются ДНК-специфичных красителей, которые дифференциально доступны для бактерий с нетронутыми против деградированных мембран, в качестве суррогата жизнеспособность бактерий. В первом рrotocol, мембрана SYTO9 проницаемой краситель определяет общее бактериальное население, в то время как иодид пропидия доступна только для тех бактерий, которые скомпрометированы мембраны и, таким образом, считается нежизнеспособным. Пропидийиодидом и SYTO9 были использованы для оценки жизнеспособности бактерий в биопленки, различать патогенные от непатогенных бактерий и перечислить жизнеспособных воду бактерий ^9-12. Во второй схеме, 4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) определяет общие бактерии, в то время как Sytox Зеленый доступен только на нежизнеспособных населения. Эти пары жизнеспособность красителя может быть объединен с иммунофлюоресценции, чтобы определить местоположение каждой бактерии в отношении представляющего интерес белка, например, чтобы определить бактериальную внутриклеточную локализацию. Использование этих анализов содержит ключевую представление о взаимодействий, которые приводят к гибели бактерий или выживание при заражении клеток-хозяев. Протоколы, изложенные в этой статье, были использованы для оценки жизнеспособностиН. гонореи, который прилагается к и внутри первичных человеческих нейтрофилов, в том числе в разных популяциях нейтрофилов фагосом ^5,13,14. Тем не менее, эти протоколы могут быть применены для оценки жизнеспособности грамположительных и грамотрицательных бактерий в профессиональных фагоцитах, непрофессиональной фагоцитов, и простейших ^15-24.