Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica
Summary
Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo sándwich de fluorescencia.
Abstract
En la presente memoria, se describe un protocolo para medir simultáneamente seis proteínas en la saliva utilizando una matriz de anticuerpos basados en microesferas de fibra óptica. La tecnología de inmuno-matriz empleada combina las ventajas de la suspensión de microesferas a base de matriz de la fabricación con el uso de microscopía de fluorescencia. Como se describe en el protocolo de vídeo, comercialmente disponibles microesferas de polímero 4,5 micras fueron codificados en siete tipos diferentes, que se diferencian por la concentración de dos colorantes fluorescentes atrapados físicamente dentro de las microesferas. Las microesferas codificadas que contienen grupos carboxilo superficiales fueron modificados con anticuerpos de captura monoclonales través de la química de acoplamiento EDC / NHS. Para ensamblar el microarray de proteínas, los diferentes tipos de microesferas codificadas y funcionalizados se mezclaron y se depositan aleatoriamente en 4,5 micras micropocillos, que fueron grabadas químicamente en el extremo proximal de un haz de fibra óptica. El haz de fibra óptica se utiliza como un portador y para obtener imágenes de la microspheres. Una vez montado, se utilizó el microarray para capturar las proteínas en el sobrenadante de la saliva obtenida de la clínica. La detección se basa en un inmunoensayo de tipo sándwich usando una mezcla de anticuerpos de detección biotinilados para diferentes analitos con una sonda fluorescente conjugada con estreptavidina, R-ficoeritrina. La micromatriz Se obtuvieron imágenes por microscopía de fluorescencia en tres canales diferentes, dos para el registro de microesferas y uno para la señal de ensayo. Las micrografías de fluorescencia se descodifican y se analizaron usando un algoritmo de hecho en casa en MATLAB.
Introduction
Desde la primera micromatriz reportado por Mark Schena y compañeros de trabajo a mediados de la década de 1990, esta potente herramienta se ha utilizado en muchos campos de la investigación biológica 1. Microarrays de anticuerpos capaces de detectar simultáneamente múltiples proteínas en los fluidos de diagnóstico, tales como la sangre, tienen aplicaciones importantes en el diagnóstico clínico y la detección de biomarcadores 2-10. La saliva, que contiene muchos de los mismos analitos como la sangre, ha sido considerada como una alternativa preferible a la sangre debido a la toma de saliva es segura, no invasiva, y puede ser llevado a cabo por el personal médico mínimamente entrenados 11-13. Actualmente, el análisis de proteínas multiplexada usando muestras de saliva está limitado por varios factores importantes, incluyendo la baja concentración de analito diana 14 y el amplio intervalo de concentración de diferentes biomarcadores 15.
.En este documento, se demuestra el análisis de seis proteínas: factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), proteína inducida por gamma-interferón 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento epidérmico (EGF), metalopeptidasa matriz 9 (MMP-9), y la interleucina-1 beta (IL-1β) . El rendimiento del método se verificó inicialmente usando soluciones estándar que constituyen las proteínas recombinantes de analito y tampón de bloqueo. Muestras de saliva real obtenida de pacientes de diferentes enfermedades respiratorias crónicas, así como también controles sanos se probaron con un rendimiento satisfactorio. El protocolo debe ser aplicable a otros analitos de proteínas y otros ensayos basados en microesferas. Esta plataforma ofrece ventajas considerables para el campo de la Química Analítica, ya que permite el análisis simultáneo rápido, preciso, y reproducible de bajas concentraciones de varias proteínas con un amplio rango dinámico, un mínimo de interacciones no específicas, la reducción del consumo de la muestra, y de bajo costo en comparación con un Ensayo inmunoenzimático análoga (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los investigadores deben prestar especial atención a los siguientes pasos: para una mayor precisión de decodificación, es necesario verificar que las microesferas fueron suspendidas de forma homogénea en toda la incubación y el lavado pasos durante el proceso de codificación de microesferas. Además, las microesferas codificadas necesitan ser protegidos de la luz a lo largo de todo el experimento. Siguiendo los procedimientos de codificación y de almacenamiento adecuadas, encontramos que la precisión global de d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (subvención 08UDE017788-05). EBP también reconoce el apoyo de la Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT). Los autores agradecen a Shonda T. Gaylord y Pratyusha Mogalisetti para la lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
Referências
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
