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Neurociência

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Published: October 08, 2013
doi:
10.3791/50696
, , , , , ,
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), 2Integrated Research Centre,University Campus Bio-medico of Rome, 3DAEMI,University of Cassino, 4National Institute of Optics (CNR-INO), 5Allen Institute for Brain Science, 6Department of Physics,University of Florence, 7ICON Foundation, Sesto Fiorentino, Italy

Summary

In diesem Artikel beschreiben wir die volle experimentelle Verfahren zu rekonstruieren, mit hoher Auflösung, feinen Hirnanatomie von fluoreszenzmarkierten Gehirn der Maus. Die beschriebenen Protokoll umfasst die Probenvorbereitung und Clearing-, Proben-Montage für Imaging, Daten Post-Processing und Multi-Skalen-Visualisierung.

Abstract

Das Verständnis der Architektur des Gehirns von Säugetieren auf Einzelzellauflösung ist eine der Schlüsselfragen der Neurowissenschaften. Abbilden neuronalen Soma und Projektionen im gesamten Gehirn ist jedoch immer noch eine Herausforderung für die Bildgebung und Datenmanagement-Technologien. Tatsächlich müssen makroskopischen Volumina mit hoher Auflösung und Kontrast in einer angemessenen Zeit rekonstruiert werden, wodurch Datenmengen im Terabyte-Bereich. Wir haben vor kurzem gezeigt, ein optisches Verfahren (konfokale Mikroskopie Lichtblatt, CLSM) der Lage ist, im Mikrometermaßstab Rekonstruktion der gesamten Gehirn der Maus mit enhanced green fluorescent protein (EGFP) markiert. Die Kombination von Lichtbogen-Beleuchtung und konfokale Detektion ermöglicht CLSM tief im Inneren makroskopischen Abbildungs ​​gelöscht Proben mit hohem Kontrast und Geschwindigkeit. Hier beschreiben wir die komplette Versuchs Pipeline, umfassende und für Menschen lesbaren Bilder der gesamten Gehirn der Maus mit fluoreszierenden Proteinen markiert erhalten. Das Clearing und die Montage pERFAHREN beschrieben, zusammen mit den Schritten, eine optische Tomographie auf seiner gesamten Volumen durch Erfassen vielen parallelen benachbarten Stapeln führen. Wir zeigten den Einsatz von Open-Source maßgeschneiderte Software-Tools ermöglichen Nähen der mehrere Stapel und Multi-Resolution-Datennavigation. Schließlich illustriert wir einige Beispiele von Gehirnkarten: das Kleinhirn von einer L7-GFP-transgenen Maus, in der alle Purkinje-Zellen selektiv markiert, und das gesamte Gehirn aus einer Thy1-GFP-M Maus, gekennzeichnet durch eine Zufalls spärlich neuronalen Kennzeichnung.

Introduction

Im Vergleich zu unserem Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen der Hirnfunktion, sieht unser Wissen von feinen Neuroanatomie immer noch in den Kinderschuhen ein. In der Tat, noch fehlen uns umfassende Karten der Position des neuronalen Zellkörper oder der langfristigen Projektionen im gesamten Gehirn. Eigentlich sind viele technologische Anstrengungen gewidmet, um die Maus Gehirn mit mikroskopischer Auflösung zu rekonstruieren. Optische Methoden, die auf Serienschnitt Harz eingebetteten Proben, als Knife-Edge-Scanning-Mikroskopie (KESM) 2, Micro-Optische Schnitte Tomographie (MOST) 3 und Fluoreszenz-MOST (fMOST) 4, können Sub-Mikrometer dreidimensionale Auflösung liefern Abbildung der gesamten Gehirn der Maus. Allerdings ist die Gesamtzeit für die Herstellung und Bebilderung einer einzigen Probe benötigt in der Grßenordnung von mehreren Wochen, wodurch die praktische Anwendung solcher Methoden. Eine weitere Technik, die auf Serienschnitt (aber ohne Harz Einbettung), Seriell Zwei-Photon Tomographie (STP) 5, ermöglicht eine hohe räumliche Auflösung Imaging. Jedoch hat diese Technik ganz Mäusegehirnen nur mit sehr wenigen Stichproben nachgewiesen, Sammelabschnitt 1 jeder 50 um 5, und unseres Wissens STP noch nicht eine vollständige Entnahme und Rekonstruktion eines murinen Gehirn produziert.

Eine innovative optische Methode, ganze Exemplare in drei Dimensionen mit hoher Geschwindigkeit rekonstruieren Lichtblatt-Mikroskopie 6. In diesem optischen System wird die Probe mit einer dünnen Licht beleuchtet und die Fluoreszenzemission entlang einer Achse senkrecht zu der Beleuchtungsebene gesammelt. Auf diese Weise nur im Fokus Fluorophore sind begeistert und es ist möglich, optische Schnitte in Weitfeld-Konfiguration zu erreichen, garantiert hohe Bildraten. Wenn zu Clearing-Protokolle auf der Basis der Substitution von Wasser mit einem Brechungsindexanpassung Flüssigkeit 7 verbunden ist, hat Lichtblatt Mikroskopie angewandtmakroskopischen Proben, als ganze Gehirn der Maus 8. Allerdings Probe-induzierten Lichtstreuung, die auch gelöscht Exemplare betrifft, verschlechtert die Lichtbogen, die zur Anregung der out-of-focus Fluorophore, die eine Gesamt Unschärfe zu den aufgenommenen Bildern erstellt.

Um selektiv sammeln nur In-Fokus-Photonen, die wir vor kurzem gekoppelt Lichtblatt Beleuchtung auf einem konfokalen Detektionsschema 9. Bei der konfokalen Mikroskopie Lichtblatt (CLSM), out-of-focus-und gestreuten Photonen werden durch eine lineare räumliche Filter (Schlitz) vor der Detektion (Figur 1) abgelehnt. Konfokale Betrieb Licht Plattenarchitektur zu erreichen, wird die Beleuchtung durch eine Abtastlinie erzeugt wird, und ein de-Scanning-System in dem Detektionspfad erzeugt ein statisches Bild des Anregungs Abtastzeile an der Stelle des Schlitzes. Eine dritte Scansystem rekonstruiert ein zweidimensionales Bild auf dem Kamerasensor. CLSM bietet eine 100% Kontrastverstärkung in frei MausGehirn gegenüber herkömmlichen Lichtblatt-Mikroskopie, während eine 10 Hz Bildrate. Mit CLSM ist es möglich, ganze Gehirn der Maus mit einer Auflösung von 2 um in XY und Z in 9 um zu rekonstruieren, und mit genügend Kontrast auf einzelne fluoreszenzmarkierten Neuronen zu erkennen.

In diesem Artikel beschreiben wir die experimentellen Pipeline, eine Maus Gehirn mit CLSM rekonstruieren. Aldehyd-fixierte Gehirn der Maus sind in einer abgestuften Reihe peroxidfreiem Tetrahydrofuran entwässert und anschließend in peroxidfreiem Dibenzylether (Abbildung 2) gelöscht, nach der von 10 gelöscht Probe Becker et al. Entwickeltes Protokoll wird dann vorsichtig auf einem gekippt montiert Platte und in der Bildraum einer maßgeschneiderten konfokalen Mikroskop Lichtblatt positioniert. Die Probe kann direkt durch Eintauchen auf einer Spitze der Platte (3a) befestigt werden, alternativ können sie auf einer Scheibe gelöscht Agarosegel (Fig. geklebt3b) oder in den Hohlraum eines Becher geräumte Agarosegel (3c) hergestellt gelegt. Eine optische Tomographie des gesamten Gehirns wird dann durchgeführt, wie viele parallele benachbarten Stapeln erworben werden, um die ganze Hirnvolumen (Abbildung 4) zu decken. Ein Pre-Tomographie Probenahme, die eine grobe Karte von der Probenposition und der Form erzeugt, gewährleistet, dass die Bildgebung wird nur das Volumen der Probe besetzt geführt. Die Tomographie-Stapel werden anschließend zusammen mit maßgeschneiderten Software genäht und in einer Multi-Resolution-hierarchischen Schema 11 gespeichert. Gehirn der Maus kann schließlich mit prototypischen Multi-Resolution-Google Maps-ähnliche Visualisierungssoftware untersucht werden. Beide Software-Instrumente sind als Plugins in der Open-Source-Plattform Vaa3D 12 integriert.

Wir zeigen schließlich repräsentative Bilder von Gehirn der Maus, um die Fähigkeiten der beschriebenen Versuchsleitung in das Studium Fein murinen neuroanatom zeigeny.

Protocol

1. Gewebevorbereitung und Lagerung Fix Mausgehirn durch Standard transkardialer Perfusion mit 20 ml 13 0,01 M Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)-Lösung, gefolgt von 100 ml 4% Paraformaldehyd in 0,01 M PBS. Den pH-Wert der beiden Lösungen sorgfältig anpassen, um 7.6: etwas niedrigere Werte der pH-Wert kann die Fluoreszenz von EGFP zu stillen. Post-fix die Köpfe ausgeschnitten über Nacht in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C Zweimal (jeweils 30 Minuten) in 0,01 M PBS spülen und Speicher in 0,01 M PBS bei 4 ° C. 2. Dehydration und Clearing Hinweis:. Das Protokoll für die Entwässerung und Abbau der ein von Becker et al 10 beschrieben, eng an Peroxide aus der Dehydratisierung Lösungsmittel (Tetrahydrofuran, THF), was stark zu löschen XFP Fluoreszenz Filter THF mit basisch aktivierten Aluminiumoxid (Aktivitätsstufe Brockmann I, etwa 250 g / l THF) unter Verwendung eines Chroma entfernengraphie Spalte. Vermeidung von Rissen der Spalte, die Peroxidentfernung reduzieren würde. Der Stabilisator (butyliertes Hydroxytoluol, 250 mg / L) nach der endgültigen Lösung, auch wenn das THF wurde bereits vor der Filtration stabilisiert. Stabilizer ist in der Tat von Aluminiumoxid beibehalten: THF ohne Stabilisator kann große Mengen an Peroxiden entwickeln und können explosive und gefährlich. Entwässern des gesamten Gehirn der Maus in einer abgestuften Reihe von THF in reinem Wasser: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, je 1 h, dann 100% über Nacht. Die Küvette mit der Probe auf einem rotierenden Rad. Um die Lichteinstrahlung zu vermeiden, wickeln Sie die Fläschchen mit einer Aluminiumfolie. Filtern Sie die Clearing-Lösungsmittel (Dibenzylether, DBE) mit Aluminiumoxid (Grund aktiviert, Aktivitätsstufe I Brockman, ca. 250 g / L DBE) unter Verwendung eines Filter Trichter. Deaktivieren Sie die Probe in 100% DBE. Ändern Sie die Lösung nach 3 und 6 Stunden. 3. Specimen Montage Wenn das Gehirn durch das Auge sieht (typisch transparenttisch 1 Stunde nach der zweiten DBE Wechsel), bringen Sie es am gekippten Bildplatte durch eine der folgenden Methoden: Direktmontage – tauchen Sie vorsichtig die Probe auf eine der Spitzen (Abb. 3a). Agarose-Disc – Tauchen Sie eine CD mit 6% Agarose-Gel auf die Tipps. Beheben Sie vorsichtig die Probe auf dem Agarose-Disc mit Acrylkleber (Bild 3b). Warten Sie etwa 1 min für die Heilung. Agarose-Becher – Tauchen Sie ein Becherglas von 3% Agarose-Gel auf die Tipps. Platzieren der Probe sanft auf dem Boden des Becherglases (Fig. 3c). Hinweis 1: Montage in Agarose Becher sollte bevorzugt werden, wenn es wichtig ist, die Abbildung der Probe in ihrer Gesamtheit werden, aber die Agarose-Gel um die Probe verursacht zusätzliche Lichtstreuung, die sich nachteilig auf die Bildqualität sein könnte. Wenn ein kleiner Teil der Probe konnte aus Abbildungs ​​ausgeschlossen werden, ist es besser, um die Spezifikation zu montierenimen auf Agarose Platte oder direkt auf die Spitze. Die erste Methode ist am besten geeignet, um das Gehirn horizontal (ohne Abbildung eines von ventralen oder dorsalen Teil des Gehirns), die letztere zu halten, um das Gehirn vertikal zu halten (ohne Abbildung eines Teils von der Riechkolben oder Rückenmark). Anmerkung 2: die Agarose-Gel sollte in Wasser für 4 Stunden hergestellt werden kann, dann dehydriert mit THF (50% und 100% jeweils 4 Stunden) und in DBE 100% gelöscht oder bis es klar durchsichtig aussieht. Nach der Montage der Probe nach einem der vorherigen Methoden, positionieren Sie die Bildplatte in der Probenkammer mit einer Pinzette. Füllen Sie die Kammer mit Clearing-Lösung. 4. Tomographie Vorbereitung Entfernen des Schlitzes, um so viel wie möglich zu sammeln Fluoreszenz. Beleuchten Sie die Probe mit niedrigem Laserleistung Ausbleichen zu verhindern. Bewegen Sie die Probe in den drei Richtungen mit Hilfe des Software-gesteuerten Mikrostell systeMeter Identifizierung für jede Richtung der minimalen und maximalen Koordinaten, für die die Probe beleuchtet und innerhalb des Sichtfeldes der Kamera (4a). Legen Sie die oben Koordinaten als Parameter für die "Pre-Tomographie" Unterprogramm. Außerdem geben den Abstand zwischen benachbarten Stapeln in der Tomographie verwendet werden, und die Vor-Tomographie Abtastschritt in z-Richtung. Starten Sie den Pre-Tomographie, die die Bilder in jedem Stapel mit der unter (4.4) angegebenen z Probenahme sammelt. Hinweis: Die gesammelten Bilder werden von einer Software verwendet, um eine grobe Karte der Probenform und Position (4b), die Beschränkung Tomographie Erwerb nur auf das Volumen tatsächlich von der Probe besetzt, wodurch Abbildungszeit und damit Photobleaching ermöglicht vorzubereiten. 5. Tomographie Acquisition Bewegen Sie die Probe außerhalb des Lichtblattes mit der Mikropositioniersystem. Increase Laserleistung und stoppen Sie die Bewegung aller Scansysteme, um nur einen Festnetzanschluss in der Mitte des Gesichtsfeldes zu beleuchten. Montieren Sie den Schlitz und richten Sie sie mit Autofluoreszenz-Signal von der Clearing-Lösung. Sie sollte deutlich die Schlitzlinie in der Mitte des Blickfeldes. Re-Aktivierung des Scansystem, Laserleistung zu reduzieren und bewegen Sie die Probe innerhalb der Lichtbogen mit der Mikropositioniersystem. Beachten Sie, dass die Laserleistung mit dem Schlitz eingesetzt wird höher als ohne sie verwendet werden, da das Raumfilter blockiert einen nicht vernachlässigbaren Anteil von Licht. Stellen Sie die Amplitude und Offset der Scan-und de-Scan-Systeme mit der Steuersoftware, bis die Bilder aussehen hell und klar. Führen Sie die Tomographie Erfassungssoftware, nach der Einstellung der entsprechenden z Schritt für das Experiment. Das Volumen wird in vielen parallelen, teilweise überlappenden Stapel (5a) abgebildet werden, und die Bilder werden gespeicherteine hierarchische Ordnerstruktur. 6. Nähte und Visualisierung Füllen Sie das erworbene Volumen mit synthetischen schwarzen Bildern (also Bilder von der gleichen Art und Abmessungen der gesammelten Einsen-, aber mit Null-Intensität) mit einem automatisierten Software (Abbildung 4c). Dieser Schritt ist notwendig, um für die Stitching-Software, um mit einer kompletten Rauminhalt beschäftigen obligatorisch. Start Vaa3D Software (von frei heruntergeladen http://www.vaa3d.org/ ) mit den Plugins TeraStitcher und TeraManager installiert. Laden Sie die TeraStitcher Plugin. Wählen Sie das Verzeichnis, das die abgebildeten Volumen, die relativen Ausrichtungen der Achsen (mit Bezug auf eine Referenz rechtshändiges Koordinatensystem) und die Voxel-Größe. Starten Sie den ersten Teil der Naht. Die Software wird die relative Verschiebung zwischen Paaren von Stacks zu berechnen, und finden Sie eine Gesamt optimale Stellung hinent für alle Stapel zusammen (Abbildung 5b). Wählen Sie die genäht Volumen in Einzel Auflösung oder in Multi-Resolution-Format zu speichern. Letzteres ermöglicht für Multi-Resolution-Visualisierung mit dem TeraManager Plugin. In beiden Fällen, wenn die höhere Bildauflösung ist größer als ein paar Gigabyte, die Multi-Stack speichern Modalität auch wählen, und geben Sie die Größe der einzelnen Teilstapel. Dies ermöglicht einen effizienten Zugriff auf die gespeicherten Daten. Starten Sie den zweiten Teil der Naht. Die Software wird die ausgerichteten Stapeln zusammenzuführen, und speichern Sie sie entweder in Einzel-oder Multi-Stack-Modus (5c und 5d). Am Ende schließen Sie die TeraStitcher Plugin. Laden Sie die TeraManager Plugin. Wählen Sie den Ordner mit der mehrfach gestapelten Multi-Resolution-Volumen und zeigen Voxelgröße und Achsen Orientierungen. Die Lautstärke wird bei der minimalen Auflösung geladen werden. Um auf eine höhere Auflösung zu vergrößern, wählen Sie ein Wahrzeichen mit der rechten Maustaste modality von Vaa3D, dann vergrößern sich mit der Maus scrollen. Alternativ können Sie auch direkt den ROI, mit einem Rechts-Klick vergrößern, oder geben Sie die Koordinaten des Volumens von Interesse. Um niedrigere Auflösung heran, verwenden Sie einfach das Mausrad.

Representative Results

Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um mit Mikrometer-Skala Auflösung entweder gesamte Gehirn der Maus oder ausgeschnitten Teile zu rekonstruieren, ohne die Notwendigkeit für physische Schnitte werden. Als ein repräsentatives Ergebnis, wie in Abbildung 6 das ganze Kleinhirn eines L7-GFP-Maus (postnatalen Tag 10) gezeigt. In diesem Tier alle Purkinje-Nervenzellen sind mit EGFP markiert. Wenn wir vergrößern, kann die typische Lamellenstruktur der Kleinhirnrinde (Abbildung 7) zu sehen. Weitere Zoomen ermöglicht eine klare Unterscheidung jedes Purkinje Zelle soma (Abbildung 8). Das beschriebene Protokoll kann somit zur neuronalen räumliche Organisation in verschiedenen neurophysiologischen Studien zu screenen. Als zweites repräsentatives Ergebnis präsentieren wir Bilder von der ungeschnittenen Gehirn eines Erwachsenen thy1-GFP-M-Maus. In dieser transgenen Tier EGFP in zufälliger spärlich neuronalen Teilmenge ausgedrückt. Die rechte Hälfte des Gehirns an in Fig. 9 gezeigt. Wie wirzoom-in weiter (Abbildungen 10 und 11), neuronale Prozesse unterscheidbar werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass die beschriebene Protokoll ermöglicht Mikrometermaßstab auflösende Bildgebung in gesamten erwachsenen Gehirn der Maus, das Öffnen der Möglichkeit des Studiums ganzen Gehirn Anatomie an zellulärer Auflösung in Mausmodellen von neurodegenerativen Erkrankungen. Fig. 1 ist. Optische Schema der konfokalen Lichtblatt-Mikroskopie (CLSM). (A) Draufsicht der Vorrichtung, die die Anregung Weg. Laseremission von einer 488 nm Diode-pumped solid state (DPSS-Laser) nach der Expansion und Kollimation durch einen ersten Teleskop, tritt in einen akustooptischen abstimmbaren Filter (AOTF), die Strahlintensität regelt. Dann wird eine zweite Teleskop weitet den Strahl. Ein Galvanometer Spiegel vertikal (entlang der y) scannt das sein Uhr, die von einer Linse in der Probenkammer ausgerichtet ist. (b) Seitenansicht der Vorrichtung, die den Erfassungspfad. Licht von der Erfassungs Objektiv gesammelt wird vertikal durch einen Galvanometerspiegel descanned und fokussiert durch eine Linse, wodurch ein Standbild des sich bewegenden Erregungsleitung. An der Position des fixierten Bildes eine lineare Raumfilter (Schlitz) angeordnet ist. Nach dem Schlitz, ein Galvo-Spiegel innerhalb eines 4f-Linsensystem angeordnet rekonstruiert ein 2-dimensionales Bild auf dem Chip einer Elektronenvervielfachungsladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD-EM). Ein Fluoreszenzbandpassfilter entfernen Sie alle Anregungsstreulicht vor der Detektion. Repräsentative Strahlen der Anregung, Detektion und bandpaßgefilterte Detektionslicht werden durch blaue, hellblau und grünen Strahlen dargestellt sind. Die Brennweiten der Objektive aller tatsächlich in der Mikroskop verwendet werden angezeigt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . jove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> 2. Proben Clearing. Formaldehyd fixierten Mäusehirnen, die in 0,1 M PBS bei 4 ° C gelagert werden (a) sind in einer abgestuften Reihe von Tetrahydrofuran dehydratisiert (THF, b) und anschließend in 100% Dibenzylether gelöscht (DBE , c). Die Entwässerungsschritt verursacht auch einige Gewebeschrumpfung. Abbildung 3. Probenhalterung für CLSM-Bildgebung. Das Gehirn kann direkt gelöscht gestürzt werden auf der Montageplatte gekippt (a), aufgeklebt auf einem Agarose gelöscht Scheibe (b), oder auf eine freie Agarose-Becher (c) eingefügt. <p class="jove_content"fo: keep-together.within-page = "always"> 4. Tomographieerfassung. Die vorge Tomographie Routineproben ein Quader, die das Gehirn (a) die Anzahl und die Länge der parallelen benachbarten Stapeln erforderlich, um alle Bild der Probe definieren (b). Nach Tomographie werden schwarze Bilder erzeugt werden, um die virtuelle erfassten Volumens zu einem quader vervollständigen (c). 5. Volume Nähten. Die gesammelten Bildstapeln überlappen teilweise untereinander (a), so dass ihre präzise Ausrichtung mit der TeraStitcher Plugin (b). Das Plugin fügt dann die ausgerichteten Stapel entweder in einem Einzel gestapelt (c) oder Multi-stacked (d) Multi-Resolution-Darstellung. 6. Ganze Kleinhirn der L7 P10-GFP-Maus, in dem alle Purkinje-Nervenzellen sind mit EGFP. Maßstabsbalken, 1 mm beschriftet. Abbildung 7. Zoom-in einen Teil des Kleinhirns in Fig. 6 dargestellt, die die typische Lamellenstruktur der Kleinhirnrinde. Maßstabsbalken 500 &mgr; m. Abbildung 8. Weitere Zoom-in eines Teils des in Fig. 6 gezeigten Kleinhirn. Purkinje-Zellen Soma klar sein unterscheidenhrsg. Maßstabsbalken, 200 um. Abbildung 9. Rechten Hälfte des Gehirns von einem erwachsenen thy1-GFP-M Maus, gekennzeichnet durch eine spärliche neuronale EGFP unspezifische Kennzeichnung. Maßstabsbalken, 1 mm. Abbildung 10. Zoom-In von einem Teil des Halb Gehirn in Fig. 9 gezeigt, die einen Teil des Hippocampus und Kortex. Maßstabsbalken 200 &mgr; m. Abbildung 11. Weitere Zoom-In von einem Teil des Halb Gehirn in Fig. 9 gezeigt. Mehrere Neuriten im Cortex klar unterschieden werden. Maßstabsbalken, 50 &mgr; m.

Discussion

CLSM gekoppelt mit chemischen Lichtung stellen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Neuroanatomie der gesamte Gehirn der Maus mit fluoreszierenden Sonden, entweder Proteine ​​oder synthetische Farbstoffen markiert studieren. Da das Licht außerhalb der Fokusebene wird durch einen physikalischen Raumfilter blockiert, ist Hochkontrast-Abbildung möglich auch in dicken Proben, unter Beibehaltung der hohen Bild typisch für Lichtbogen-Architektur Raten.

Das Hauptproblem, mit, wenn mit den beschriebenen Methoden umzugehen, ist die Maximierung der Kontrast. In der Tat, die verfügbaren Signal sowohl durch chemische und optische Faktoren reduziert. Vom chemischen Standpunkt aus können die Clearingverfahren auf Basis organischer Lösemittelemission von fluoreszierenden Proteinen und anderen fluoreszierenden Farbstoffen 7 stillen. Filtration des Lösungsmittels zu entfernen Peroxide, wie von Becker et al. 10 beschrieben, ermöglicht die Aufrechterhaltung einer guten Niveau der Fluoreszenz auch in lösemittel gelöscht Gewebe. Veröffentlichened auf Wasserbasis Clearingverfahren 14 nicht reduzieren Fluoreszenzeffizienz, aber zu schlechteren Transparenz im Umgang mit der gesamten Maus-Gehirn, zumindest bei linearen optischen Techniken.

Auf der anderen Seite, im Moment gibt es keine kommerziellen Ziele mit großem Arbeitsabstand für den hohen Brechungsindex (n ≈ 1.56) Clearing-Lösungen eingesetzt korrigiert. Somit wird der Brechungsindex-Fehlanpassung zwischen dem Medium, in dem die Probe eingetaucht und die Gestaltung einer der Ziel führt zu starken sphärischen Aberrationen. Neben der Verringerung der Auflösung des Mikroskops führen solche Aberrationen in einem Tropfen Bildintensität und der Kontrast, da das Licht auf eine größere Fläche verteilt. Mögliche Workarounds für dieses Problem sind die Verwendung der adaptiven Optik 15 und / oder statische asphärische Korrektoren.

Jede Verbesserung des Bildkontrastes und Intensität leicht wirkt sich auch der Abbildungsgeschwindigkeit, da eine kürzereIntegrationszeit pro Bild kann ausgewählt werden. Im Moment CLSM kann ein Abbildungsgeschwindigkeit von etwa 10 6 um 3 / s leisten, mit einer Kamera, Belichtungszeit von 100 ms 9. Bei dieser Geschwindigkeit dauert es 1-3 Tage, um ein ganzes Bild Gehirn der Maus, je nach Probengröße. Obwohl keine signifikante Verschlechterung der Bildqualität ist ganz so langen Bildgebungssitzung, vor allem wegen der niedrigen intrinsischen Photobleaching Lichtbogen Beleuchtung 6 beobachtet, die lange Zeit, um ein einziges Bild benötigt Gehirn der Maus konnte in der Praxis reduzieren die Anwendbarkeit der CLSM. Eine 10-fache Steigerung der Effizienz des Systems, verbunden mit der Verwendung einer Hochgeschwindigkeitskamera zum Nachweis würde Abbildungszeit bis zu mehreren Stunden zu reduzieren, so dass eine routinemäßige Anwendung des beschriebenen Protokoll.

Trotz all der oben genannten Einschränkungen, CLSM Bildgebung zur chemischen Reinigung der Gewebe ermöglicht gekoppelt gesamte Gehirn der Maus mit Mikrometer-Skala zu rekonstruieren Auflösung in weniger als einWoche. Andere optische Methoden für die gesamte Bildgebung des Gehirns leisten höhere Auflösung als CLSM, aber um den Preis einer längeren Vorbereitung und / oder Belichtungszeit 4.2 oder einer spärlich z 5 Probenahme.

Die in diesem Artikel beschriebenen Verfahren können in Kombination mit verschiedenen Strategien zur Fluoreszenzmarkierung eingesetzt werden: transgenen Tiere exprimieren fluoreszierende Proteine ​​in ausgewählten neuronalen Untergruppen, virale Transfektion intraparenchymal Farbstoff Injektion usw. In der Praxis mit CLSM kompatibel sind alle Färbung Strategien vorangehenden Tieropfer . In der Tat hat Post-mortem-Fluoreszenzmarkierung des gesamten Gehirn der Maus nicht nachgewiesen, dass sie jetzt jedenfalls, wenn diese Art der Färbung würde in naher Zukunft möglich sein, die Anzahl der Proben, die mit CLSM rekonstruiert werden konnten, werden viel größer werden, möglicherweise einschließlich der menschlichen Hirngewebe.

Abschließend konfokalen Mikroskopie Lichtbogen in Kombination mit tis verwendetsue Clearing-und Multi-Resolution-Datenmanagement kann den Forschern ermöglichen, mit einer Auflösung im Mikrometer-Skala zu rekonstruieren und zu analysieren, makroskopische Proben mit technologischen Bemühungen, die gut von der Hand der meisten Labors sind. Mögliche Anwendungen der CLSM sind natürlich nicht die Neurowissenschaften beschränkt, sondern erstreckt sich über alle Forschungsfelder, in denen Lichtblatt-Mikroskopie wurde bereits verwendet worden, wie Embryogenese 16,17 und Anatomie von Kleintieren 18.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarungen n erhalten. 228334 und 241526. Dieses Forschungsprojekt wurde auch von Human Frontier Science Program Forschungsstipendium (RGP0027/2009) unterstützt und vom italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung im Rahmen der Flagship-Projekt Nanomax und von italienischen Gesundheitsministerium im Rahmen der "Stem Cells Aufruf zur Einreichung von Vorschlägen". Diese Forschung wurde im Rahmen der Forschungsaktivitäten der Stiftung, die von ICON "Ente Cassa di Risparmio di Firenze" unterstützt durchgeführt.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline Tablets Sigma-Aldrich P4417_100TAB
Paraformaldehyde Agar Scientific R1018
Peroxide-free Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I Sigma-Aldrich 199443
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014
Butylated hydroxytoluene Sigma-Aldrich W218405
Agarose Type III-A, High EEO Sigma-Aldrich A9793
Acrylic glue Bostik D2498
Vaa3D software open source freely downloadable from http://www.vaa3d.org/
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Referências

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Silvestri, L., Bria, A., Costantini, I., Sacconi, L., Peng, H., Iannello, G., Pavone, F. S. Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (80), e50696, doi:10.3791/50696 (2013).
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