Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Os mastócitos são altamente granulado células imunes efetoras que servem como mediadores importantes na asma, alergias, parasitas defesa e carcinogênese ^13-16. Eles residem em quase todos os tecidos vascularizados ^15, onde armazenar com segurança os mediadores inflamatórios e alérgicos em grânulos citoplasmáticos até ser ativado para desgranulam. Degranulação é a exocitose de grânulos à membrana, o que resulta na liberação de mediadores farmacologicamente ativos, tais como a histamina, triptase, leucotrienos e ^15. Este processo resulta na iniciação de reacções de hipersensibilidade do tipo I, que são críticas para a montagem de defesa contra parasitas bem como o início de reacções alérgicas, asma, e ¹⁵ cancerígenas.

Os mastócitos e basófilos, FceRI expressam receptores, os receptores de alta afinidade para a imunoglobulina E (IgE) ^17. A exposição a um alergénio ou antigénio provoca a agregação de múltiplos receptores de IgE FceRI ligados ^17, e é este so-chamada "reticulação" de receptores Fc de IgE ligadas, que inicia o processo de desgranulação: uma cascata de acontecimentos de fosforilação de tirosina, a activação de fosfolipase C, o efluxo de cálcio das reservas internas, e influxo de cálcio para dentro da célula ^18. Este influxo de cálcio é necessária para a desgranulação e, ainda, sinaliza a fusão com a membrana dos grânulos antes de causar a exocitose de grânulos ^15. Experimentalmente, um ionóforo de cálcio pode ser utilizada para transporte de cálcio directamente através da membrana da célula ^19, o que evita essencialmente todas as etapas de transdução de sinal, antes da etapa ²⁰ do influxo de cálcio, permitindo a identificação de um alvo por via de um tóxico como estando a montante ou a jusante de cálcio de sinalização ^20.

Degranulação pode ser medido de forma rápida e eficaz, o controlo da libertação de β-hexosaminidase no sobrenadante de células, que é libertada a partir dos grânulos de forma linear juntamente com a histamina ^6, mas ié muito mais fácil de detectar utilizando uma reacção enzima-substrato simples e um leitor de microplacas para análise do produto fluorescente. Este ensaio de microplacas, como descrito na secção do protocolo, baseia-se num método robusto originalmente desenvolvida por Naal et ai. ^1, que quantifica a clivagem do substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-N-acetil–D-β glucosaminide por β- hexosaminidase. Nós modificamos o ensaio para efeitos de teste de drogas e substâncias tóxicas, com triclosan destaque aqui. Este método quantifica fiável desgranulação, é uma alternativa de baixo custo para, por exemplo, o fluxo de métodos de detecção baseados em citometria de ^21, e tem o potencial de se prestar bem para rastreio de alto rendimento de uma grande variedade de fármacos anti-alérgicos, assim como imunotóxicas ou substâncias químicas alergênicas. Este último ponto é particularmente importante, tendo em conta o relatório do Conselho Nacional de Pesquisa 2007 "Ensaios de Toxicidade no ^Século 21: Uma visão e uma StratEGY "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), que preconiza para o desenvolvimento de testes de toxicologia de alto rendimento que utilizam a cultura de células para reduzir a utilização dispendiosa de animais tradicionais, tais como ratinhos de laboratório. O protocolo desenvolvido pela desgranulação Naal et ai. ^1, e modificada por nós ^2, utiliza a linha de células RBL-2H3, que é um modelo bem aceite homóloga aos mastócitos das mucosas humanas ou basófilos ^3-5. (Métodos para a cultura de células RBL-2H3 estão detalhados em Hutchinson et al. ^22). Este ensaio poderia provavelmente ser adaptado a qualquer tipo de célula mastro em anexo.

Triclosan (TCS) é um antimicrobiano de amplo espectro que tem sido utilizado por mais de 30 anos em hospitais, produtos de cuidados pessoais e de bens de consumo ^23,24. O modo de ação para a característica antimicrobiana da TCS é a inibição da biossíntese de ácidos graxos, provavelmente inibindo enoil-acilproteína transportadora reductase ^25,26. É encontrado em todo o mundo em uma ampla gama de produtos de consumo, tais como gel de banho, loção para as mãos, creme dental, enxaguatório bucal, e na mão sabonetes em concentrações de até 0,3% ou 10 mM ^24. O uso generalizado de TCS resultou em níveis detectáveis ​​em humanos ^27-29 e em rios e córregos ^30. Um estudo feito pela Allmyr et al. ²⁷ demonstraram que a TCS e seus metabólitos estão presentes tanto no plasma e no leite de mães que amamentam. Importante, a TCS é facilmente absorvido pela pele ^31-37. Queckenberg et ai. Encontrado ³⁷ ~ 10% a absorção de um ~ 70 mM TCS creme na pele humana, dentro de 12 horas, resultando em uma concentração significativa na pele, onde residem os mastócitos.

SCT foi demonstrado clinicamente para controlar a doença alérgica da pele humana ^7-11, mas o mecanismo pelo qual a TCS alivia as doenças alérgicas de pele tem sido desconhecido ^38. Usando o ensaio de fluorescência de microplacas detailed neste vídeo, demonstramos recentemente que a TCS, a concentrações tão baixas quanto 2 uM, atenua significativamente a função de mastócitos e desgranulação, proporcionando uma potencial explicação para estes dados clínicos ^2. Além de proporcionar uma explicação para estes dados clínicos, os nossos resultados em Palmer et al. ² sugerem que a TCS de sinalização tem como alvo a jusante das moléculas do influxo de cálcio. Devido à importância da sinalização de cálcio em muitos outros processos imunológicos e biológicos, a TCS poderia ter efeitos adversos sobre uma ampla variedade de processos biológicos necessários. Na verdade, Udoji et al. ³⁹ mostrou que TCS suprime a atividade das células natural killer humano lítico, outra função imune inato importante.

Para além do seu potencial como uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele (ou, inversamente, como um immunotoxicant), TCS também pode ser um disruptor endócrino ^40-49. Assim, um procedimento claro de como preparar este produto químico em solução is de interesse para os toxicologistas. Porque SCT é uma pequena molécula hidrófoba, os veículos orgânicos são muitas vezes utilizados para torná-lo mais solúvel em água. Na maioria dos estudos de toxicidade em que a TCS foi testado, a preparação envolveu a dissolução em água com o auxílio de um solvente orgânico tal como etanol, acetona, ou óleo ^2,50,51. No entanto, muitas vezes esses solventes são biologicamente ativa-se, complicando assim a interpretação da substância em estudo de dados ^51. Na verdade, de acordo com Rufli et al. ⁵² e outros ^53, recomenda-se que as soluções de ensaio para ensaios de toxicidade aquática são preparadas utilizando métodos físicos sobre os métodos químicos, devido ao potencial de solventes químicos para criar artefactos de toxicidade. Nós mostramos anteriormente que a TCS dissolvido em 0,24% de etanol / água (v / v) e sonicado por 30 min amortece RBL degranulação dos mastócitos ^2. O etanol em concentrações mais elevadas do que 0,24% foi mostrado para amortecer degradação mastócitoscanulação ^54,55, exemplos dos efeitos potencialmente de confusão de solventes orgânicos em estudos de toxicidade.

Não só é importante ter em conta o efeito de solventes no organismo ou células utilizadas para o estudo, mas também é importante para monitorizar o efeito de um solvente sobre o próprio produto químico de teste. Por exemplo, Skaare et ai. Dissolvendo ⁵¹ descobriram que a TCS em polietileno-glicol (normalmente encontrados nos dentífricos e bochechos) atenuou os efeitos anti-bacterianos e anti-placa em mulheres saudáveis ​​do sexo feminino durante a dissolução em óleos provocou uma perda completa de função. Portanto, a capacidade de diferentes solventes para modular tóxico e de drogas, incluindo TCS, efeitos devem ser considerados no desenho do ensaio. A utilização de óleos ou aditivos de sabor pode interferir com os efeitos de TCS em vários produtos ^50,51.

Num esforço para eliminar a necessidade de utilizar solventes orgânicos, que melhorado para o nosso método de dissolução TCS ^2, eliminando o uso de um sol orgânicadesabafar. No presente protocolo, dissolver TCS grânulos diretamente em tampão aquoso com o calor (≤ 50 ° C) e, em seguida, verificar a concentração desse estoque TCS por espectrofotometria de UV-Vis. Estas melhorias são possíveis porque SCT é solúvel em água até 40 uM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) e tem sido demonstrado que resistem à degradação quando aquecido a 50 ° C ( http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. Também tem a vantagem de espectrofotometria de UV-Vis, como TCS também é conhecido por absorvem fortemente a 280 nm, com um ⁵⁸ coeficiente de extinção molar de 4,200 L / mol / cm ^12.

Este protocolo oferece uma maneira simples, mas eficaz para dissolver TCS grânulos para um tampão, sem o auxílio de um solvente orgânico, incluindo o baixo custo e rápida verificaçãode concentração e descreve um ensaio de microplaca fluorescente poderoso para monitorar os efeitos químicos sobre a degranulação dos mastócitos.