Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular
Summary
המאמר מתאר מתודולוגיה לייצור מטריצת acellular ממעי חולדה. הגזירה של פיגומי מעיים חשובה ליישומים עתידיים בתחום הנדסת רקמות, ביולוגיה של תאי גזע ובדיקות סמים.
Abstract
הנדסת רקמות מוצלחת כרוכה בשילוב של פיגומים עם תאים מתאימים במבחנה או in vivo. פיגומים עשויים להיות סינטטיים, באופן טבעי, שהופק או שמקורם ברקמות / איברים. האחרון מתקבלים באמצעות טכניקה המכונה decellularization. Decellularization עשוי להיות כרוך בשילוב של פיזי, כימי, ושיטות האנזימטית. המטרה של טכניקה זו היא להסיר את כל העקבות הסלולריות תוך שמירה על ארכיטקטורת מיקרו מקרו ושל הרקמה המקורית.
הנדסת רקמות מעיים עד כה השתמשה בפיגומים פשוטים יחסית שלא ישכפל את הארכיטקטורה המורכבת של האיברים הילידים. המוקד של מאמר זה הוא לתאר טכניקת decellularization יעילה למעי דק חולדה. הבידוד של המעי דק, כדי להבטיח השמירה על חיבור של כלי דם מתואר. השילוב של פתרונות כימיים והאנזימטית כדי להסיר את תאי whilst שימור הציר סיסי-קריפטה בהיבט luminal של הפיגום הוא גם יצא לדרך. לבסוף, הערכה של פיגומים הופקו עבור מאפיינים המתאימים לדיון.
Introduction
הנדסת רקמות (TE) מספקת אלטרנטיבה טיפולית להשתלת איברים, תוך עקיפת סוגיות של דיכוי חיסוני ומחסור באיברים. TE היה לאחרונה יישומים מוצלחים במרפאת, עם החלפה של איברים כגון שלפוחית השתן 1, 2 שופכה ואת קנה הנשימה, הן במבוגרים 3,4 וילדים 5.
בניית איבר רקמות מהונדסות מחייבת שילוב של פיגום עם התאים המתאימים. פיגום ניתן להכין באמצעות טבעית הנגזר (למשל קולגן) ו( חומצה למשל פולי-L-גליקולית; PLGA) סינתטית חומרים, או להשיג על ידי decellularization של איברים ורקמות מקומיים. פיגומים שהיו בשימוש עד כה לTE מעיים היו בעיקר שני decellularized (submucosa מעי הדק) או סינטטי (חומצת פולי-L-גליקולית וחומצה לקטית פולי) 6-13. חומרים ביולוגיים אלה הם פשוטים מאוד בשתי ארכיטקטורת מיקרו מקרו ו, אשרלא יכול להיות אידיאלי אם מעי רקמות מהונדסות הוא להיות מתורגם מבחינה קלינית. ביולוגי אופטימלית למעי צריך עץ בכלי דם מולדת שיכול להיות מחובר לאספקה של מארח דם, קיר צינורי שכבתי עם מאפיינים שונים על מנת לשקף את שכבות דופן המעי וציר סיסי-קריפטה בצד luminal כדי לסייע עם אכלוס על ידי תאי גזע אפיתל.
Decellularization הוא מתודולוגיה חדשנית שמייצרת פיגומים על ידי הסרת תאים מאיברים שלמים תוך שמירה על הארכיטקטורה המקורית שלהם 14. זה עדיף על קיים כבר פיגומים שכן הם לא רק לשכפל את המבנה של האיבר אבל גם מכילים אותות כימיים המוטבעים בתוך המטריצה תאית (ECM) שהתרבות תאי סיוע ובידול. בשנת 2008 קנה הנשימה מגופות היה decellularized 14, נזרע עם תאים של החולה עצמו, ומושתל להחליף את הסמפונות השמאל העיקרית בבחור צעיר <sup> 3. מאז, מספר הקבוצות דיווחו הייצור של פיגומי decellularized ללב 15, הכבד 16,17, וריאות 18-20 בבעלי חיים קטנים וגדולים.
יש לנו גם להתאים אותן השיטות כדי לייצר פיגום decellularized מעי דק 21. המטרה של השיטה המתוארת במסמך זה היא לייצר מטריצות מעיים decellularized, כי לשמור על המאפיינים מקרוסקופית של רקמה המקורית כגון אספקת הדם, כמו גם את הארכיטקטורה המיקרוסקופית של הציר סיסי-קריפטה בחלל המעי. אנו מאמינים במתודולוגיה זו סופו של דבר יכולה להיות מאומץ על איברים אחרים כדי לשפר את היעילות של decellularization.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצעדים הקשים ביותר בהקמת ניסוי זה כרוך cannulation של SMA והקמה והתחזוקה של עקרות. Cannulating SMA במכרסמים ללא פקיעת הקיר יכול להיות די קשה בשל הגודל והמיקום של כלי השיט. לחלופין, תפר ניתן להציב סביב אב העורקים הפרוקסימלי לפני המוצא SMA, ואחריו cannulation של אב העורקים עצמו distally, בימוי צינורית הפלסטיק לתוך SMA. במהלך decellularization שילוב של מיקום צינורית עני וספיקות גבוהות עלול לגרום לאבד את הגישה של כלי הדם. עקרות היא בעיה רצינית עקב כמות של חי חיידקים הנמצאים במעי הדק. שטיפה עם PBS / AA הבאה קציר היא מאוד חשובה, וכל סימן של עניין או פסולת בצואה יש להסיר מלומן. הצבת חלק מהפיגום בצינור בז עם DMEM בחממה הבאה עיקור UV צריכה להיות אינדיקטור אם עקרות הושגו. במקרההקולוניזציה חיידקים, התקשורת תשנה את ה-pH עם הצבע שלו הופך מאדום לצהוב. כדי להתמודד עם זה, מחזורי UV נוספים מומלץ וכן כביסה עם PBS המכיל ריכוז גבוה של האנטיביוטיקה / antimycotic.
שינוי להסיג לך פיגום עם גישת שני כלי דם וורידים יהיה cannulate נחות הווריד הנבוב (IVC), כמו גם מחברת SMA. Decellularization מצדדי ורידים וכלי דם צריך להיות ניסיון לסירוגין במשך כל שלושת הפתרונות. decellularization המתמשך עלול להתפוצץ נימי הדם על ידי שיש לחץ חיובי על שני הצדדים.
במהלך השנים היו מספר ניסיונות במעיים TE באמצעות שילובי תא פיגום שונים במבחנה in vivo 6,9,12. רוב העבודה שבוצע באמצעות פיגומי PLGA צינורי 95%% PGA-5 לא ארוגים מצופים בסוג אני 6,7,13,22 קולגן. הזריעה הבאה עם מעייםיחידות אפיתל organoid (יחידות ארגוניות) ותקופה של השתלה לתוך omentum של עכברים, הם יוצרים ציסטות בשרירים בצד החיצוני והאפיתל בחלק הפנימי אשר לאחר מכן ניתן tubularized. עם זאת, הנקבוביות והפשטות בעיצוב של פיגומים אלה אינם מאפשרים לדור של חתיכות גדולות של מעי מלאכותי בסביבה במבחנה כמו זו של bioreactor. בנוסף, המחסור ברשת כלי דם מולדת שיכול להיות מחוברת לנמען נוסף מגבילה את השימוש בפיגום הזה לתרגום קליני. חוץ מהניסויים עם פיגומי PGA-PLGA, קבוצות אחרות השתמשו בפיגומי קולגן או SIS, אשר שניהם לא לשכפל את המורכבות של מערכת העיכול. SIS בפרט הוא המתודולוגיה שפורסמה קודמת רק של הנדסת רקמות מעיים וכבר בשימוש בלמעלה מ 150 הגדרות רפואיות, הממחיש את יכולתה של פיגומי decellularized לספק יציבות מכאנית ולקדם את צמיחת תאים תוך הובלהing לשום תגובת immunogenic. עם זאת, חוסר ארכיטקטורת מיקרו מקרו ומתאים, הוביל לתוצאות גרועות בשימוש בו "למטרות TE מעיים 9-11,23.
היתרונות של מתודולוגיה decellularization שתארנו כוללים את שימור מאפיינים מיקרוסקופיים כגון ארכיטקטורת קריפטה-סיסי luminal המייצגים את הסביבה מתאימה לאכלוס על ידי הנישה תאי גזע במעי. בהיבט מאקרוסקופי, הנוכחות של רשת כלי דם היררכית תאפשר קובץ מצורף לנמען, המאפשרת מתן חומרי מזון וחמצן לכל השכבה של TE-המעי 21. מה הוא יותר, התחזוקה של רכיבי ECM כגון קולגן, אלסטין וglyocosaminoglycans יש תפקיד חשוב לא רק למאפיינים מכאניים, אלא גם מכוונים את הריבוי והתמיינות תאיים. והכי חשוב, את היכולת של המתודולוגיה decellularization להיות מדורגת עד לגדולרקמות r תוך שמירה על אותם המאפיינים היא תכונה חשובה לתרגום קליני של TE.
הפיתוח של מטריקס מעיים טבעי עם רשת כלי דם מאפשר יצירה של מגזרים גדולים יותר של מעי מלאכותי שיכול להיות מחובר למחשב המארח.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים וייק פורסט המכון לרפואת רגנרטיבית לעזרתם עם פיתוח של פרוטוקול זה. אנו מכירים תמיכה על ידי תרומות של הצדקה רחוב גרייט אורמונד בבית החולים, הקרן Eugenio Litta (ז'נבה, שוויץ), המועצה למחקר הרפואי, מכללת מנתחים המלכותית של אנגליה, הצדקה הרפואית של ניצוצות הילדים, משרד החוץ הבריטי לבריטניה / ארה"ב גזע פרס שיתוף פעולה נייד וקרן המחקר למיטאל. כמו כן, אנו רוצים להודות לקרן החברה המלכותית / וולפסון למענק שיפוץ מעבדת הנדסת רקמות שהתקבל למחלקה לכירורגיית הילדים במכון לבריאות ילד. PDC ו SE נתמך על ידי הצדקה של רחוב אורמונד בית החולים לילדים הגדולים.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
Referências
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
- Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).
- Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).
- Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).
- Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. Angiogenesis in tissue-engineered small intestine. Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).
- Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , 1-8 (2010).
- Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for lung engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).
- Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).
- Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).
- Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).
