JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

Matrix asistida por láser de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas Análisis de las proteínas intactas de más de 100 kDa

Published: September 09, 2013
doi:
10.3791/50635
,
1Institute of Structural Biology “J.P. Ebel”, UMR5075, Commissariat à L’Energie Atomique et aux Energies Alternatives (CEA), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS),Université J. Fourier

Summary

Medición de la masa exacta representa un paso importante en la investigación de las proteínas. Matrix asistida por láser de desorción / ionización (MALDI) espectrometría de masas (MS) se puede utilizar para tal determinación y su ventaja fundamental es la tolerancia a las sales, detergentes y los contaminantes. Aquí se ilustra un enfoque accesible para el análisis de proteínas más grandes de 100 kDa por MALDI-MS.

Abstract

Determinar eficazmente masas de proteínas es fundamental para muchos estudios biológicos (por ejemplo, para las investigaciones de biología estructural). Determinación de la masa exacta permite evaluar la exactitud de secuencias primarias de proteínas, la presencia de mutaciones y / o modificaciones posteriores a la traducción, la posible degradación de la proteína, la homogeneidad de la muestra, y el grado de la incorporación de isótopos en caso de etiquetado (por ejemplo, 13 C etiquetado ).

Ionización electrospray (ESI) espectrometría de masas (MS) se utiliza ampliamente para la determinación de la masa de las proteínas desnaturalizadas, pero su eficiencia se ve afectada por la composición del tampón de muestra. En particular, la presencia de sales, detergentes, y contaminantes socava gravemente la eficacia del análisis de proteína por ESI-MS. Desorción por láser asistida por matriz / ionización (MALDI) La EM es una alternativa atractiva, debido a su tolerancia a la sal y la sencillez de la adquisición de datos e interpretaciónción. Por otra parte, la determinación de la masa de grandes proteínas heterogéneas (más grande que 100 kDa) es más fácil por MALDI-MS debido a la ausencia de la superposición de las distribuciones de estado de carga altos que están presentes en los espectros de ESI.

Aquí presentamos un enfoque accesible para el análisis de proteínas más grandes que 100 kDa por MALDI-tiempo de vuelo (TOF). Se ilustra las ventajas de utilizar una mezcla de dos matrices (es decir, ácido 2,5-dihidroxibenzoico y ácido α-ciano-4-hidroxicinámico) y la utilidad del método de capa fina como enfoque para la deposición de la muestra. También discutimos el papel crítico de la matriz y la pureza solvente, de las normas utilizadas para la calibración, de la energía láser, y del tiempo de adquisición. En general, proporcionamos la información necesaria para un novato para el análisis de proteínas intactas de más de 100 kDa por MALDI-MS.

Introduction

Biología estructural se basa en la producción de proteínas de alta calidad 1 y por lo tanto tiene que ir acompañada de técnicas eficientes y confiables para el análisis de proteínas 2,3. En nuestra espectrometría de masas (MS) de laboratorio dentro de un instituto de biología estructural que necesitamos para confirmar la secuencia primaria de proteínas, evaluar la presencia de mutaciones y modificaciones posteriores a la traducción, la degradación de proteínas, la homogeneidad de la muestra, y la calidad de marcaje isotópico (por ejemplo deuterado proteínas para estudios de resonancia magnética nuclear 4). Dado que los biólogos estructurales utilizan la proteólisis limitada para distinguir los dominios estructuralmente rígidas a partir de piezas flexibles, tenemos que caracterizar de forma fiable estas proteínas truncadas usando MS.

Cuando las biomoléculas son analizados por MS, dos posibles enfoques se utilizan para ionizar suavemente tales moléculas pesadas y lábiles. Ionización por electropulverización (ESI) ioniza moléculas directamente desde elfase líquida 5; ionización desorción por láser asistida por matriz (MALDI) requiere que las biomoléculas se co-cristalizado con moléculas orgánicas absorben en el ultravioleta (es decir, la matriz de moléculas) 6.

ESI-tiempo de vuelo (TOF) MS acoplada a cromatografía de líquidos se ha convertido en una técnica de rutina para el análisis de proteínas intactas, ya que permite la determinación de masa con alta precisión (≤ 50 ppm). Sin embargo, es muy susceptible a la composición del tampón de muestra (en particular a las sales y detergentes) y a los contaminantes (es decir, polímeros) que a veces son difíciles de eliminar, provocando la supresión de la señal de analito.

MALDI-TOF MS representa una alternativa eficaz a ESI-MS debido a que su rendimiento se ve menos afectada por los componentes del tampón, detergentes y contaminantes, y permite la determinación de masa de la proteína intacta con una precisión suficiente (≤ 500 ppm) para la validación de secuencia. Después de proteinurian digestión, MALDI-TOF MS puede también utilizarse para analizar los péptidos obtenidos para una mayor confirmación de la secuencia primaria por el llamado "peptide mass fingerprinting".

En nuestras manos, la determinación de la masa de proteínas intactas, que son mayores que 100 kDa y heterogénea (debido a modificaciones o truncamientos), es más fácil por MALDI-MS que por ESI-MS. Esto es debido a la falta de distribuciones de estado de carga superpuestas presentes en los espectros de ESI. Por otra parte, ya que el proceso MALDI no depende del tamaño de analito 7, tales rendimientos método de alta sensibilidad cuando una masa biomolécula está por encima de 100 kDa. Análisis notables de proteínas intactas se llevaron a cabo utilizando instrumentos caseros entre el final de la década de 1980 y principios de la 1990 de 8-11.

MALDI-TOF puede también ser utilizado como herramienta de cribado para evaluar la calidad de las muestras de proteínas, ya que requiere menos tiempo para la preparación de la muestra y es menos susceptible a INTERFERENces debido a las impurezas comunes (por ejemplo, sales). Después de un primero, la evaluación rápida por MALDI-MS, una muestra puede ser analizada más por ESI-TOF para determinar su masa con una exactitud más alta. Además, MALDI genera iones que contienen un menor número de cargos que ESI y por lo tanto la adquisición y la interpretación de datos de MALDI es más sencillo. Esto permite a los estudiantes que trabajan en la biología estructural para analizar sus proteínas recombinantes justo después de un breve entrenamiento.

Dos factores principales que influyen en la calidad de los espectros de MALDI: la matriz y la técnica utilizada para la deposición de matriz (por ejemplo, la gotita se secó 8 y la capa delgada 12-16,17,18). Una sola matriz orgánica [por ejemplo, ácido sinapínico (SA) 19-21 o-4-hidroxicinámico α-ciano ácido (α-CHCA) 14,22,23] se utiliza a menudo para el examen de MS de proteínas intactas y complejos de proteínas reticuladas . El uso de α-CHCA, grupo Chait presentó previamente un protocolo detallado para preparing una capa ultra fina antes del análisis MALDI de proteínas solubles y de membrana 14,15. Recientemente, Gorka et al. Ilustra el recubrimiento de destino a base de grafito para mejorar el análisis de MALDI de péptidos y proteínas utilizando α-CHCA como matriz 24.

Aquí, se presenta un protocolo simple para el análisis de proteínas intactas por MALDI-TOF MS, utilizando una mezcla de dos matrices: ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y α-CHCA 25. Se evaluó sistemáticamente el rendimiento de la mezcla de DHB-CHCA en comparación con las matrices de SA y α-CHCA, para el control de las proteínas intactas. La mezcla de la matriz permite una mejor resolución (es decir, los picos de las proteínas son mucho más aguda). Por otra parte, la presencia de iones intensos múltiples cargas (es decir, M +2 H + 2, H 3 H 3 +, etc) permite una determinación de la masa más precisa debido a que la resolución de los instrumentos de MALDI-TOF axiales es mayor a menor masa sobre carga (m / z) 26. Esto es particularmente útil para la determinación del peso molecular de las proteínas de más de 100 kDa.

Una mayor sensibilidad también se alcanza mediante la mezcla de DHB-CHCA (0,5 pmoles de proteína manchas en la diana MALDI).

Como mencionamos anteriormente, un factor importante que se debe considerar al utilizar instrumentos MALDI es la deposición de la matriz. Laugesen et al. Propusieron el uso de la mezcla de DHB-CHCA por primera vez 25, la utilización de la deposición de gotitas que se secó. Sin embargo, hemos observado mejores resultados (por ejemplo, sensibilidad mucho más alta) cuando se utilizó el método de capa fina en donde la primera capa está formada por la α-CHCA disuelto en acetona. La capa delgada método de 12,27 implica la formación de un sustrato homogénea de cristales de la matriz sobre la diana de MALDI, que se describió en un video Júpiter previamente 15. Luego, la muestra se deposita sobre este substrato, y finalmentematriz adicional se deposita (ver más abajo). En este artículo, también ilustran cómo depositar la muestra en la diana MALDI, sino también la forma de limpiar el objetivo del 15, para recristalizar, y preparamos las matrices.

Para concluir nuestro objetivo es ofrecer toda la información necesaria para el análisis de proteínas intactas para los científicos (en particular, los biólogos estructurales) que necesitan para evaluar la calidad de las proteínas producidas de una manera rápida y sencilla y que no están tan familiarizados con MALDI-TOF MS. Como se predijo, a mediados de la década de 1990 28, MS ha tenido un mayor impacto en la investigación biológica, como su accesibilidad a los biólogos ha aumentado. Esperamos que la información que ha entregado será útil para hacer MALDI-TOF accesible para los biólogos y científicos que deseen comenzar a utilizar la espectrometría de masas.

Protocol

1. Preparación de proteínas de la muestra: Buffer Exchange (Opcional) 5-25 l de concentraciones micromolares de proteína (1 a 20 mM) son necesarios. El cambio de tampón se puede llevar a cabo utilizando dispositivos de ultrafiltración centrífuga (por ejemplo Vivaspin, Sartorius) o columnas de filtración en gel de microcentrífuga (por ejemplo, Micro Bio-spin 6 columnas de cromatografía, Bio-Rad) 29,30. Etapas de intercambio de búfer se puede repetir 2-3x. Descripción detallada de intercambio de tampón fue previamente presentada 29,30. Por ejemplo, utilizamos Tris 20 mM (hidroximetil) aminometano (es decir, Tris) de pH 8 como tampón final. Nota: Este paso podría ser omitido en muchos casos. Se debe llevarse a cabo cuando una muestra de proteína contiene moléculas o tampones que podrían interferir fuertemente con detección MS [por ejemplo, glicerol; 4 – (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico ácido, HEPES]. También es útil para mejorar la qulidad de los espectros. 2. La recristalización de matrices a fin de mejorar su pureza (Opcional) Verter 10 ml de etanol al 40% (EtOH) en un matraz de Pyrex. Añadir 600 mg de una matriz. El uso de un baño de agua y un calentador de resistencia, calentar la solución de matriz y se remueve hasta que la matriz se disuelve por completo con una varilla de vidrio o un agitador magnético. Repita el paso 2 hasta que haya una solución saturada. Nota: El uso de un volumen demasiado grande de disolvente o disolución de la matriz muy por debajo del punto de ebullición de la solución causará un pobre rendimiento de cristales o cristales no hay en absoluto. Deje que la solución se enfríe lentamente. Se puede dejar a temperatura ambiente durante varias horas y luego a 4 ° C durante la noche. Nota: si no se forman cristales, la cristalización se puede inducir por el rascado el interior del vaso de precipitados (justo debajo de la superficie de la solución) con una varilla de vidrio. Recoge los cristales de la matriz por filtración. Enjuague los cristales con una cantidad mínima de disolvente enfriado con hielo y filtrar ellos. Permita que los cristales se sequen. Usted puede utilizar el vacío para este paso. 3. Limpieza de MALDI de acero inoxidable Target Enjuague la placa de MALDI con metanol (MeOH) y limpie suavemente con un pañuelo de limpieza especialmente para aplicaciones de laboratorio (por ejemplo Kimwipe). Enjuague el objetivo con H 2 O y límpielo con un pañuelo de limpieza. Introduzca la placa de MALDI en un vaso de 600 ml y cubrirla con un 50% de EtOH. Sonicar la diana en la solución de EtOH durante 10 min en un baño de ultrasonidos. Si hay residuos que quedan en el plato, repita los pasos 1-4 de nuevo. Por último, aclarar el objetivo con MeOH (o con agua, vea la nota de abajo), la inclinación de una manera que todo el líquido se recoge en un tejido de limpieza. Deje que el objetivo seco a temperatura ambiente o con un nitrógenoflujo de gas. Nota: Un procedimiento similar fue descrito previamente 15. Nota: El disolvente (MeOH o agua) utilizado para el último enjuague del objetivo determina algunas de las características del objetivo. Si el objetivo se enjuagó con MeOH, la muestra se extienda en el objetivo mucho más que cuando se utiliza agua. 4. α-CHCA Thin Layer Solución: Preparación y deposición en el Target MALDI Disolver α-CHCA en acetona con el fin de hacer que una solución saturada. A mano (sin pipeta) sumergir un l punta 10 (por ejemplo GELoader Consejo, Eppendorf) en solución saturada α-CHCA: una pequeña cantidad de la solución fluirá en la punta (por capilaridad). Toca muy rápidamente (es decir, 1 segundo) el objetivo MALDI con puntas de pipeta y depositar la solución de acetona-α CHCA en la diana MALDI. Esta constituirá la capa fina de matriz, donde la proteínamuestra se deposita. Trate de generar un lugar de capa fina lo más pequeño posible. Nota: Cuando se utiliza como matriz SA, preparamos una capa fina utilizando una solución saturada de SA en acetona. 5. Preparación de las soluciones Natrix: SA, α-CHCA, DHB y CHCA_DHB Mezcla 25 Preparar una solución de 20 mg / ml de SA en ACN, 0,1% de TFA (70:30, vol / vol). Preparar 20 mg / ml solución α-CHCA en ACN y 5% de ácido fórmico (70:30, vol / vol) [llamado como "solución de α-CHCA"]. Preparar una solución de 20 mg / ml de DHB en ACN y 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) (70:30, vol / vol) [llamado como "solución de DHB"]. Mezclar "solución α-CHCA" y "solución DHB" en proporción de 1:1 (vol / vol), para obtener la "solución CHCA_DHB". Nota: Se puede mezclar "solución α-CHCA" y "solución DHB", en diferentes proporciones, al analizar las proteínas con una masa inferior a 100 kDa. Para example una proporción de 40:60 entre α-CHCA y DHB (vol / vol) proporciona una mejor resolución, pero menos sensibilidad (véase la discusión). 6. La deposición de la muestra en el Target MALDI Depósito de 0,5 l de la muestra de proteína en la capa delgada α-CHCA previamente preparada. Inmediatamente después de eso, añadir 0,5 l de la disolución de la matriz (es decir, la solución SA o de la solución α-CHCA o la "mezcla CHCA_DHB"). Esto implica mezclar la muestra y la matriz en el objetivo. Nota: Por lo general, se mezcla la muestra de proteína con la matriz en una proporción de 1:1. Esta relación es crítica para la buena calidad de los espectros de MALDI. Si usted desea probar diferentes concentraciones de la muestra, puede utilizar la solución de ácido ACN_formic (descrito anteriormente) para diluir la muestra. Nota: Si lo prefiere, puede mezclar la muestra y la matriz en un tubo y luego depositar el mixto "sample_matrix soluciónción "en la capa delgada. Nota: Le sugerimos que pruebes diferentes concentraciones de la muestra debido a la dilución de la muestra le permite reducir la interferencia de contaminantes. Para diluir la muestra, puede utilizar la solución de ácido ACN_formic (descrito anteriormente) para diluir la muestra. 7. Calibrant Deposition Depósito 0.5 l de la norma calibrante (por ejemplo, "estándar de la proteína II", Bruker Daltonics, Bremen) y luego añadir 0,5 l de la disolución de la matriz. Nota: Cargue el calibrador en la placa de MALDI junto a los puntos de muestra de proteína (véase el debate). 8. MALDI Spectra Adquisición de Calibrant y la proteína muestras Una vez que se secan las muestras y el calibrador, se pueden observar las "manchas" en el microscopio. Esta observación es opcional y puede ser interesante sobre todo para los novatos. Para adquirir los espectros de la muestra, insertar ªcorreo de destino en el instrumento MALDI-TOF y elegir los parámetros instrumentales apropiadas que son diferentes para cada tipo de equipo. Para obtener la más adecuada puesta a punto hay que seguir las recomendaciones del fabricante. Como consideraciones generales al analizar las proteínas intactas, se debe utilizar el instrumento en el modo lineal (no en modo reflector, lo cual es apropiado para los péptidos análisis). Normalmente utilizamos nuestro instrumento en el modo de iones positivos. Por otra parte, un parámetro clave es la "extracción de iones de impulsos", que mejora la resolución instrumentales 31. En términos simples, la "extracción de iones en pulsos" se puede definir como una pausa entre la generación de los iones de la muestra y el tiempo en que los iones se aceleran hacia el detector. Al analizar las proteínas intactas, uno debería utilizarse una "extracción de iones de impulsos" (por ejemplo, 500 nanosegundos) más grande que cuando se observa péptidos (por ejemplo, 80 ns). Seleccione el rango de m / z adecuada, adquirir el o los espectrosf el calibrador, y calibrar el instrumento. Al adquirir los espectros de las muestras, utilice la intensidad del láser adecuado (véase el debate).

Representative Results

Se analizaron una proteína intacta (región del cromosoma de mantenimiento 1 proteína, Crm1; peso molecular: 123.386 Da) utilizando dos matrices diferentes, dos métodos de deposición, y la misma intensidad del láser (Figura 1). SA y una mezcla CHCA_DHB se utilizaron como matrices. La mezcla dio espectros de masas de mayor calidad en términos de relación señal a ruido y de la sensibilidad (Figuras 1A y B). En particular, se podría detectar 0,5 pmoles de proteína depositada en la diana MALDI (Figura 1C). La misma cantidad de proteína fue apenas detectable usando SA (Figura 1D). Por otra parte, el uso de la mezcla de las matrices, el método de elección para la deposición de la matriz fue el enfoque de "capa delgada" (Figura 1A). Utilizando el método de "secado gota", que no detectó ninguna proteína con una masa superior a 100 kDa (datos no presentados). Utilizando la mezcla CHCA_DHB (Figuras 1A y 1C), multiplicar cargado de iones de la proteinurian se observaron, lo que permite la determinación de la masa con mayor precisión debido a que la resolución de los picos en los instrumentos de MALDI-TOF axiales es inversamente proporcional a la m / z 26. También analizamos monomérica beta-galactosidasa (116.300 Da) (Figura 2). Los espectros CHCA_DHB eran mejores que los espectros SA en términos de sensibilidad y resolución. Por otra parte, la presencia de iones de carga múltiple (M 2 +, 3 + M y M 4 +) nos permitió confirmar la masa de la proteína con una mayor precisión (Figuras 2A y 2C). Utilizando el enfoque de capa fina, se compararon los resultados de la mezcla de CHCA_DHB, SA y solo α-CHCA para el análisis de una inmunoglobulina, IgG (148.500 Da) (Figura 3). Cuando nos relacionamos los diferentes datos, señales de la proteína eran más altos y con mejor resolución en los espectros CHCA_DHB. Para concluir, el uso de la mezcla de CHCA_DHB y el método de deposición de capa fina demostrado mejoras significativas en la calidad de gran espectros de masas de la proteína intacta adquirida usando un instrumento de MALDI TOF. Figura 1. Análisis MALDI-TOF de la proteína de la región del cromosoma intacto mantenimiento 1, (Crm1), peso molecular: 123386 Da. A) 1 pmol de Crm1 se analizó utilizando la mezcla DHB_CHCA como matriz B) Importe:. 1 pmol Matriz:. SA C) Importe: 0,5 pmoles Matriz:. DHB_CHCA D) Importe: 0,5 pmoles Matriz: SA. La señal de los picos, expresado en una escala de unidad de intensidad arbitraria, se normaliza para el valor máximo presente en cada espectro. pg "src =" / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg "/> Figura 2. Análisis MALDI-TOF de intacta beta-galactosidasa (116.300 Da). A) Importe: 20 pmoles; DHB_CHCA matriz B) Importe:. 20 pmoles Matriz:. SA C) Importe: 5 pmoles Matriz:. DHB_CHCA D) Importe: 5 pmoles Matriz: SA. Figura 3. Análisis MALDI-TOF de una inmunoglobulina intacta, IgG (148.500 Da); cantidad:. 1,7 pmoles los espectros obtenidos mediante la mezcla CHCA_DHB eran mucho más intensa (máximo: 8200 unidad arbitraria, au) que los espectros SA (máximo: 1.200 au) y los espectros de α-CHCA (máximo: 4.500 au)

Discussion

Se presenta un protocolo de detalle para adquirir espectros de masas de alta calidad de las grandes proteínas intactas con pesos moleculares superiores a 100 kDa, utilizando un instrumento MALDI-TOF. Un número de aspectos críticos referentes a la preparación de la muestra debe ser considerado cuidadosamente con el fin de mejorar la calidad de los espectros de masas. Las matrices y los disolventes de alta pureza tienen una importancia fundamental, ya todos los contaminantes presentes en las matrices y los disolventes se concentran en el objetivo MALDI después de la evaporación del disolvente. Con el fin de mejorar la pureza de las matrices MALDI es posible purificar utilizando métodos de recristalización clásicos (véase más arriba). También recomendamos a los recién preparar las soluciones de matrices (por lo menos una vez a la semana) para mejorar la cristalización de la matriz y para evitar la degradación de la matriz.

El enfoque de la deposición de matriz es muy crítico para la calidad final de los espectros. Como se describió anteriormente, el método de capa fina es nuestro método de Oelección f 12. Por otra parte, hemos optimizado el enfoque para depositar la primera capa. Cuando se disuelve la matriz en acetona para obtener una solución saturada, la propanona permite la evaporación rápida del disolvente, sino que también hace que el tamaño de la primera capa muy difícil de controlar. Le recomendamos que utilice una punta GELoader tan poco pincel que se baña en la solución matrix_acetone para obtener un volumen mínimo que usted deposita rápidamente en el objetivo. El tamaño de la primera capa controla de alguna manera el tamaño final de la mancha de MALDI: un pequeño punto (es decir, 0,5-0,75 mm de diámetro) es preferible porque en este caso la concentración de la muestra es mayor que en el caso de un punto grande. La obtención de un pequeño punto difiere del enfoque de capa ultrafina propuesto previamente en un vídeo JOVE 15. En Fenyo et al. La solución de capa delgada se extiende por todo el objetivo MALDI usando el lado de la punta de la pipeta. Este enfoque requiere probar la fina capa que debe satisfacer criterios específicos(Por ejemplo, la velocidad de evaporación del disolvente). Si no se cumple el criterio, el objetivo MALDI debe ser lavado y una nueva capa delgada debe estar preparado. Esto hace que la preparación bastante laborioso para un novato. Además, la deposición de la mezcla de muestra / matriz en la placa requiere la aspiración del exceso de disolvente utilizando una línea de vacío y una etapa de lavado utilizando TFA 15 es necesario, haciendo que el Fenyo et al. Preparación un poco más difícil que nuestro enfoque.

La relación en volumen entre la matriz y la muestra es bastante importante para un análisis exitoso de proteínas intactas por MALDI-TOF. Después de probar diferentes relaciones se aconseja utilizar una proporción de 1:1. Una matriz diferente: proporción de la muestra podría comprometer la calidad de los espectros, probablemente debido a la cristalización no homogénea. El orden en el que se depositan matriz y la muestra es también crítico. Después de depositar la capa fina de matriz, la muestra se deposita e inmediatamente después (antes de la sample mancha se vuelve seca) se añade la mezcla CHCA_DHB. Este procedimiento se ha definido como "método sándwich" 27, donde se deposita la muestra sola entre dos capas de matriz. Como alternativa, la solución CHCA_DHB y la muestra se pueden mezclar en el tubo de 0,5 ml y luego se mancha sobre la capa delgada CHCA 12. Esto produce un lugar con una capa homogénea de cristales resultantes en espectros de alta calidad. Cuando el análisis de proteínas con una masa inferior a 100 kDa, la concentración de DHB se puede aumentar (por ejemplo, 60:40 DHB: CHCA), lo que puede producir pico más agudo, pero podría comprometer la sensibilidad de la medición (es decir, picos menos intensos).

Para una correcta calibración del instrumento, es esencial para depositar las normas calibrantes muy cerca de los puntos de muestra, lo que permite a uno obtener una mejor exactitud de la masa. Un "procedimiento de calibración pseudo interno" se sugirió anteriormente 15: después de la adquisición de un espectro de la muestra, el punto i calibrantes láser de disparo y la señal del calibrador se añaden a la espectro de la muestra. Esto le permite calibrar internamente el espectro de la muestra utilizando los picos calibrantes.

La energía del láser debe ser también controlado cuidadosamente durante la adquisición de espectros. En la mayoría de los casos, mayor energía aumenta la sensibilidad, pero reduce la resolución. Le recomendamos que utilice el mínimo de energía posible láser sin comprometer la sensibilidad de la adquisición. Por otra parte, para mejorar la calidad espectral, se puede adquirir más disparos a cada punto de la muestra. Normalmente los tiros más que usted adquiera (1.000-2.000 disparos), mayor es la intensidad de la señal. Al golpear el terreno con el láser, hay que encontrar la posición correcta (es decir, "sweet spot"), ya que la muestra no se distribuye de forma homogénea. Usted puede disparar en la misma zona hasta que la señal va en aumento, y luego tratar de encontrar otra área que contiene la muestra.

En conclusión, de alta pureza de las matrices y moldes SOLVpadres, los métodos utilizados para la muestra y matrices de deposición en el destino, la posición de las normas utilizadas para la calibración, la intensidad de la energía del láser, el momento de la adquisición (número de disparos / spot) son factores críticos que hay que tener en cuenta a la hora el análisis de proteínas intactas por MALDI-TOF MS.

Contribuciones de autor

LS y EBE diseñado los experimentos, realizó los experimentos de espectrometría de masas, analizaron los datos, y escribió el manuscrito.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Christophe Masselon (IRTV, CEA, Grenoble) y miembros de la infección viral y el Grupo de Cáncer en el SII, para su evaluación crítica del manuscrito y útil para los debates. Estamos muy agradecidos a Cyril Dian para el tipo de regalo de la proteína Crm1. Este trabajo científico se llevó a cabo en las instalaciones de la espectrometría de masas de Grenoble Instruir Centre (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Se contó con el apoyo financiero de la Infraestructura francés para Integrated Structural Iniciativa Biología (Frisbi, ANR-10-INSB-05-02), GRAL (ANR-10-labx-49-01) [dentro de la Asociación de Grenoble para Biología Estructural] y por el Centro Nacional Francés para la Investigación Científica (CNRS).

Materials

      REAGENTS
Trizma hydrochloride Sigma T3253  
Trizima Sigma T6066  
Micro Bio-Spin 6 chromatography columns Bio-Rad 732-6221  
Vivaspin 500 Sartorius VS0122 various molecular weight cut off
Methanol Fluka 14262  
Ethanol Fluka 02860  
KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers Kimberly Clark 05511  
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich C8982  
Acetone Sigma Aldrich 650501  
2,5-dihydroxybenzoic acid Fluka 39319  
GELoader Tips Eppendorf 0030 001.222  
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998  
Formic acid Fluka 09676  
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031  
Protein Standard II Bruker Daltonics 207234 It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine
Immunoglobulin G ABSciex GEN602151  
      [header]
      EQUIPMENT
Water purifier PURELAB Ultra Analytic ELGA LabWater 89204-052  
Autoflex MALDI-TOF instrument Bruker Daltonics    
MALDI-TOF target Bruker Daltonics    
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Rupp, B. . Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).
  2. Cohen, S. L., Chait, B. T. Mass spectrometry as a tool for protein crystallography. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).
  3. Chait, B. T. Mass spectrometry–a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist. Structure. 2, 465-467 (1994).
  4. Gans, P., et al. Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).
  5. Wilm, M. Principles of electrospray ionization. Molecular & cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407 (2011).
  6. Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets. Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).
  7. De Hoffmann, E., Stroobant, V. . Mass Spectrometry: Principles and Applications. , (2007).
  8. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
  9. Spengler, B., Cotter, R. J. Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis. Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).
  10. Beavis, R. C., Chait, B. T. High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).
  11. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).
  12. Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins. Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).
  13. Xiang, F., Beavis, R. C. A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
  14. Cadene, M., Chait, B. T. A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins. Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
  15. Fenyo, D., et al. MALDI sample preparation: the ultra thin layer method. J. Vis. Exp.. (3), e192 (2007).
  16. Gabant, G., Cadene, M. Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features. Methods. 46, 54-61 (2008).
  17. Hook, P., et al. Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).
  18. Vorm, O., Roepstorff, P. Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).
  19. Beavis, R. C., Chait, B. T. Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).
  20. Madler, S., Boeri Erba, ., E, R., Zenobi, MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules. Topics in current chemistry. , (2012).
  21. Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes. The Analyst. 132, 199-207 (2007).
  22. Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry. Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).
  23. Liu, Z., Schey, K. L. Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).
  24. Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).
  25. Laugesen, S., Roepstorff, P. Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).
  26. Sparkman, D. O. . Mass Spectrometry Desk Reference. , (2000).
  27. Kussmann, M., Roepstorff, P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS. Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).
  28. Wang, R., Chait, B. T. High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins. Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).
  29. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. J. Vis. Exp. (40), e1954 (2010).
  30. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nature protocols. 2, 715-726 (2007).
  31. Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).

Tags

MALDI-TOFMass SpectrometryIntact ProteinsProtein AnalysisProtein CharacterizationLarge ProteinsProtein Mass DeterminationSample PreparationMatrixCalibrationLaser EnergyAcquisition Time

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. (79), e50635, doi:10.3791/50635 (2013).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image