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Química

Matrix-assisted laser di desorbimento / ionizzazione Time of Flight (MALDI-TOF) Massa spettrometrica Analisi delle proteine ​​intatte grande di 100 kDa

Published: September 09, 2013
doi:
10.3791/50635
,
1Institute of Structural Biology “J.P. Ebel”, UMR5075, Commissariat à L’Energie Atomique et aux Energies Alternatives (CEA), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS),Université J. Fourier

Summary

Misura della massa accurata rappresenta un passo importante nel corso dell'inchiesta di proteine. Matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) spettrometria di massa (MS) può essere utilizzato per tale determinazione e il suo vantaggio chiave è la tolleranza di sali, detergenti e contaminanti. Qui illustriamo un approccio accessibili per l'analisi di proteine ​​più grandi di 100 kDa tramite MALDI-MS.

Abstract

Determinare efficacemente masse di proteine ​​è fondamentale per molti studi biologici (ad esempio per le indagini di biologia strutturale). Accurata determinazione della massa permette di valutare la correttezza della sequenza primaria della proteina, la presenza di mutazioni e / o modificazioni post-traduzionali, la possibile degradazione delle proteine, l'omogeneità del campione, e il grado di isotopo incorporazione in caso di etichettatura (ad esempio 13 C etichettatura ).

Ionizzazione elettrospray (ESI) spettrometria di massa (MS) è ampiamente usato per la determinazione della massa di proteine ​​denaturate, ma la sua efficienza è influenzato dalla composizione del tampone campione. In particolare, la presenza di sali, detergenti e contaminanti compromette fortemente l'efficacia di analisi delle proteine ​​da ESI-MS. Matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) MS è un'alternativa interessante, grazie alla sua tolleranza al sale e la semplicità di acquisizione dati e interpretazionezione. Inoltre, la determinazione della massa di grandi proteine ​​eterogenee (più grande di 100 kDa) è più facile da MALDI-MS per l'assenza di sovrapposizione distribuzioni alta carica dello stato che sono presenti negli spettri ESI.

Presentiamo qui un approccio accessibile per analizzare le proteine ​​più grandi di 100 kDa mediante MALDI-tempo di volo (TOF). Illustriamo i vantaggi di usare una miscela di due matrici (cioè acido 2,5-diidrossibenzoico e acido α-ciano-4-idrossicinnamico) e l'utilità del metodo strato sottile come approccio per la deposizione del campione. Discutiamo anche il ruolo critico della matrice e la purezza del solvente, degli standard utilizzati per la calibrazione, l'energia laser, e del tempo di acquisizione. Nel complesso, forniamo le informazioni necessarie per un novizio per l'analisi di proteine ​​intatte più grandi di 100 kDa di MALDI-MS.

Introduction

Biologia strutturale si basa sulla produzione di proteine ​​di alta qualità 1 e deve quindi essere accoppiato con tecniche efficienti ed affidabili per l'analisi di proteine ​​2,3. Nel nostro spettrometria di massa (MS) laboratorio entro un istituto di biologia strutturale è necessario confermare sequenza primaria delle proteine, valutare la presenza di mutazioni e modificazioni post-traduzionali, la degradazione delle proteine, l'omogeneità del campione, e la qualità di etichettatura isotopica (es deuterato proteine ​​per studi di risonanza magnetica nucleare 4). Dal momento che i biologi strutturali utilizzano proteolisi limitata per distinguere i domini strutturalmente rigidi da parti flessibili, abbiamo bisogno di caratterizzare in modo attendibile tali proteine ​​tronche con MS.

Quando biomolecole sono analizzati da MS, due possibili approcci sono utilizzati per ionizzare dolcemente tali molecole pesanti e labili. Ionizzazione electrospray (ESI) ionizza le molecole direttamente dalfase liquida 5; matrix-assisted laser desorbimento di ionizzazione (MALDI) richiede che le biomolecole sono co-cristallizzati con molecole organiche-ultravioletti di assorbimento (cioè matrice molecole) 6.

ESI tempo di volo (TOF) MS accoppiata alla cromatografia liquida è diventata una tecnica di routine per l'analisi di proteine ​​intatte, perché permette la determinazione della massa con elevata precisione (≤ 50 ppm). Tuttavia, è molto sensibile alla composizione del tampone campione (in particolare sali e detergenti) e di contaminanti (cioè polimeri) che sono talvolta difficili da eliminare, causando la soppressione del segnale dell'analita.

MALDI-TOF MS rappresenta una valida alternativa alla ESI-MS, perché le sue prestazioni è meno influenzata da componenti tampone, detergenti e contaminanti, e permette proteina intatta la determinazione della massa con sufficiente precisione (≤ 500 ppm) per la convalida sequenza. Dopo Protein digestione, MALDI-TOF MS può essere utilizzata anche per analizzare i peptidi ottenuti per ulteriore conferma sequenza primaria dalla cosiddetta "massa peptide fingerprinting".

Nelle nostre mani, la determinazione della massa di proteine ​​intatte, che sono più grandi di 100 kDa ed eterogeneo (a causa di modifiche o troncamenti), è più facile da MALDI-MS che da ESI-MS. Ciò è dovuto alla mancanza di distribuzioni stato di carica sovrapposti presenti negli spettri ESI. Inoltre, poiché il processo MALDI non dipende dalle dimensioni analita 7, tali rendimenti metodo ad alta sensibilità quando una massa biomolecola è superiore a 100 kDa. Analisi notevoli di proteine ​​intatte sono state effettuate utilizzando strumenti fatti in casa tra la fine del 1980 e l'inizio del 1990 8-11.

MALDI-TOF può anche essere usato come strumento di screening per valutare la qualità di campioni proteici perché richiede meno tempo per la preparazione del campione ed è meno suscettibile di INTERFERENces dovute a impurità comuni (ad esempio sali). Dopo una prima, rapida valutazione tramite MALDI-MS, un campione può essere ulteriormente analizzato mediante ESI-TOF per determinare la sua massa con maggiore precisione. Inoltre, MALDI genera ioni contenenti meno spese rispetto ESI e quindi acquisizione e l'interpretazione dei dati MALDI è più semplice. Questo permette agli studenti che lavorano nel campo della biologia strutturale per analizzare le proteine ​​ricombinanti subito dopo una breve formazione.

Due fattori chiave influenzano la qualità degli spettri MALDI: la matrice e la tecnica utilizzata per la deposizione di matrice (gocciolina es essiccati 8 e sottile strato 12-16,17,18). Una matrice organica singolo [ad esempio acido sinapinic (SA) 19-21 o α-ciano-4-idrossicinnamici acido (α-CHCA) 14,22,23] è spesso usato per l'esame MS di proteine ​​intatte e complessi proteici reticolato . Utilizzo di α-CHCA, gruppo Chait precedentemente presentato un protocollo dettagliato per la preparing uno strato ultra sottile prima dell'analisi MALDI di proteine ​​solubili e di membrana 14,15. Recentemente, Gorka et al. Illustrato il rivestimento bersaglio a base di grafite per migliorare l'analisi MALDI di peptidi e proteine ​​utilizzando α-CHCA come matrice 24.

Qui, presentiamo un semplice protocollo per l'analisi di proteine ​​intatte mediante MALDI-TOF MS, utilizzando una miscela di due matrici: acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) e α-CHCA 25. Sistematicamente valutato le prestazioni del mix DHB-CHCA rispetto alle matrici SA e α-CHCA, per il controllo di proteine ​​intatte. La miscela di matrice permette una migliore risoluzione (cioè i picchi di proteine ​​sono molto più nitida). Inoltre, la presenza di intense multipli ioni spese (cioè M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, ecc) consente una più precisa determinazione della massa perché la risoluzione degli strumenti MALDI-TOF assiale è maggiore a massa inferiore sopra la carica (m / z) 26. Ciò è particolarmente utile per la determinazione del peso molecolare delle proteine ​​più grandi di 100 kDa.

Maggiore sensibilità viene raggiunta anche mediante la miscela DHB-CHCA (0,5 pmoli di proteine ​​macchiati sul target MALDI).

Come abbiamo accennato in precedenza, un fattore importante che deve essere considerato quando si utilizzano strumenti MALDI è la deposizione di matrice. Laugesen et al. Proposto l'uso della miscela DHB-CHCA per la prima volta 25, utilizzando la deposizione gocciolina essiccata. Tuttavia, abbiamo osservato risultati migliori (ad es sensibilità molto più alto) quando abbiamo utilizzato il metodo sottile strato in cui il primo strato è formato da α-CHCA disciolto in acetone. Il sottile strato metodo 12,27 implica la formazione di un substrato omogeneo di cristalli matrice sul target MALDI, che è stato descritto in un video Giove precedenza 15. Poi, il campione viene depositato su questo substrato, e infinematrice aggiuntiva viene depositata (vedi sotto). In questo articolo, abbiamo anche illustrare come per depositare il campione sul bersaglio MALDI, ma anche come pulire l'obiettivo del 15 per ricristallizzare, e prepariamo le matrici.

Per concludere ci proponiamo di fornire tutte le informazioni necessarie per l'analisi di proteine ​​intatte agli scienziati (in particolare, i biologi strutturali) che hanno bisogno di valutare la qualità delle proteine ​​prodotte in maniera rapida e semplice e che non hanno molta familiarità con MALDI-TOF MS. Come previsto a metà del 1990 28, MS ha avuto un maggiore impatto sulla ricerca biologica, come la sua accessibilità ai biologi è aumentato. Ci auguriamo che le informazioni che abbiamo fornito saranno utili per rendere MALDI-TOF accessibili ai biologi e scienziati che vorrebbero iniziare a utilizzare la spettrometria di massa.

Protocol

1. Preparazione Protein Sample: Buffer Exchange (opzionale) 5-25 microlitri di concentrazioni micromolari di proteine ​​(1 a 20 mM) sono necessari. Scambio buffer può essere effettuata utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione centrifuga (ad esempio Vivaspin, Sartorius) o colonne di filtrazione gel microcentrifuga (ad esempio, Micro Bio-Spin 6 colonne per cromatografia, Bio-Rad) 29,30. Procedura di cambio Buffer possono essere ripetuti 2-3x. Descrizione dettagliata dello scambio di buffer è stato precedentemente presentato 29,30. Ad esempio, utilizziamo tris 20 mm (idrossimetil) aminometano (cioè Tris) pH 8 come buffer di finale. Nota: Questo passaggio potrebbe essere omesso in molti casi. Dovrebbe essere eseguita quando un campione proteina contiene molecole o buffer che potrebbe fortemente interferire con MS rilevamento [es glicerolo, 4 – (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido, HEPES]. E 'anche utile per migliorare la qunalità degli spettri. 2. Recrystallization di matrici al fine di migliorare la loro purezza (facoltativo) Versare 10 ml di 40% etanolo (EtOH) in un pallone Pyrex. Aggiungere 600 mg di una matrice. Utilizzando un bagno di acqua e un riscaldatore a resistenza, riscaldare la soluzione di matrice e mescolate finché la matrice è completamente sciolto con una bacchetta di vetro o un agitatore magnetico. Ripetere il passo 2 fino ad ottenere una soluzione satura. Nota: Utilizzando un eccessivo volume di solvente o sciogliere la matrice di sotto del punto di ebollizione della soluzione provoca una scarsa resa di cristalli o cristalli di affatto. Lasciare che la soluzione raffreddare lentamente. Si può lasciarla a temperatura ambiente per diverse ore e poi a 4 ° C durante la notte. Nota: se non si formano cristalli, la cristallizzazione può essere indotta da graffiare l'interno del bicchiere (appena sotto la superficie della soluzione) con una bacchetta di vetro. Raccogliere i cristalli della matrice per filtrazione. Risciacquare i cristalli con una quantità minima di solvente ghiacciata e filtrato. Lasciare i cristalli asciugare. Potete usare il vuoto per questo passo. 3. Pulizia di MALDI acciaio inossidabile di destinazione Sciacquare la piastra MALDI con metanolo (MeOH) e strofinare delicatamente con un panno di pulizia appositamente per applicazioni di laboratorio (ad es Kimwipe). Sciacquare il bersaglio con H 2 O e pulirla con un panno di pulizia. Inserire la piastra MALDI in un becher da 600 ml e coprire con il 50% EtOH. Sonicare la porta nella soluzione EtOH per 10 minuti in un bagno ad ultrasuoni. Se ci sono residui rimasti sul piatto, ripetere i passaggi 1-4, ancora una volta. Infine, risciacquare il bersaglio con MeOH (o con acqua, la nota seguente), inclinarlo in un modo che è raccolto tutto il liquido su un tessuto di pulizia. Lasciare la porta a secco a temperatura ambiente o con un azotoflusso di gas. Nota: Una procedura simile è stato descritto in precedenza 15. Nota: Il solvente (metanolo o acqua) utilizzati per l'ultimo risciacquo del bersaglio determina alcune caratteristiche bersaglio. Se il bersaglio viene risciacquata con MeOH, il campione si sparga sul bersaglio molto più di quando si usa acqua. 4. α-CHCA sottile strato Soluzione: Preparazione e Deposizione sul target MALDI Sciogliere α-CHCA in acetone per ottenere una soluzione satura. A mano (senza pipetta) immergere un microlitri punta 10 (ad esempio GELoader Tip, Eppendorf) in α-CHCA soluzione satura: una piccola quantità della soluzione fluirà nella punta (per capillarità). Toccare molto rapidamente (ossia 1 sec) il target MALDI con puntale e depositare la soluzione di acetone α-CHCA sul target MALDI. Questo costituirà lo strato sottile matrice, dove la proteinacampione sarà depositato. Prova a generare un punto strato sottile il più piccolo possibile. Nota: Quando si utilizza SA come matrice, prepariamo uno strato sottile con una soluzione satura di SA in acetone. 5. Preparazione di Natrix Solutions: SA, α-CHCA, DHB e CHCA_DHB Miscela 25 Preparare una soluzione di 20 mg / ml SA in ACN, 0,1% TFA (70:30, vol / vol). Preparare 20 mg / ml soluzione α-CHCA in ACN e il 5% di acido formico (70:30, vol / vol) [chiamato come "soluzione di α-CHCA"]. Preparare una / soluzione DHB ml 20 mg in ACN e acido 0,1% trifluoroacetico (TFA) (70:30, vol / vol) [chiamato come "soluzione DHB"]. Mix "soluzione α-CHCA" e "soluzione DHB" in rapporto 1:1 (vol / vol), per ottenere la "soluzione CHCA_DHB". Nota: Si può mescolare "soluzione α-CHCA" e "soluzione DHB" in rapporti diversi, quando si analizzano le proteine ​​con massa inferiore a 100 kDa. Per example un rapporto di 40:60 tra α-CHCA e DHB (vol / vol) produce una risoluzione migliore, ma meno sensibilità (vedi la discussione). 6. Deposizione del campione sul target MALDI Cassetta 0,5 microlitri del campione proteico sullo strato sottile α-CHCA precedentemente preparato. Subito dopo, aggiungere 0,5 ml di soluzione di matrice (cioè la soluzione SA oppure la soluzione α-CHCA o il "mix CHCA_DHB"). Ciò implica la miscelazione del campione e la matrice sul bersaglio. Nota: Di solito si mescola il campione di proteine ​​con la matrice in un rapporto di 1:1. Questo rapporto è fondamentale per la buona qualità degli spettri MALDI. Se volete testare diverse concentrazioni del campione, è possibile utilizzare la soluzione di acido ACN_formic (sopra descritto) per diluire il campione. Nota: Se si preferisce, è possibile mescolare il campione e la matrice in un tubo e poi depositare il misto "sample_matrix soluzionezione "a strato sottile. Nota: Si consiglia di testare diverse concentrazioni del campione perché diluendo il campione consente di ridurre l'interferenza di contaminanti. Per diluire il campione, è possibile utilizzare la soluzione di acido ACN_formic (sopra descritto) per diluire il campione. 7. Calibratore Deposizione Cassetta di 0,5 ml di standard calibrante (ad esempio "proteina normale II", Bruker Daltonics, Bremen) quindi aggiungere 0,5 ml di soluzione di matrice. Nota: Caricare il calibrante sulla piastra MALDI accanto ai punti di campionamento delle proteine ​​(vedi la discussione). 8. MALDI Spectra Acquisizione di Calibrant e proteine ​​Campioni Una volta che i campioni ed il calibrante vengono essiccati, si possono osservare le "macchie" sotto un microscopio. Questa osservazione è opzionale e può essere interessante soprattutto per i novizi. Per acquisire gli spettri campione, inserire the destinazione nello strumento MALDI-TOF e scegliendo i parametri strumentali appropriati che sono differenti per ciascun tipo di apparecchiatura. Per ottenere il più appropriato set-up si dovrebbe seguire le raccomandazioni del produttore. Come considerazioni generali quando si analizzano proteine ​​intatte, si dovrebbe usare lo strumento in modalità lineare (non in modalità riflettore, che è appropriato per i peptidi analisi). Normalmente utilizziamo il nostro strumento in modalità positiva di litio. Inoltre, un parametro chiave è il "estrazione di ioni pulsata", che migliora la risoluzione strumentale 31. In termini semplici, il "estrazione ione impulsiva" può essere definito come una pausa tra la generazione di ioni del campione e il momento in cui gli ioni vengono accelerati verso il rivelatore. Quando si analizzano proteine ​​intatte, bisogna utilizzato un "estrazione di ioni impulsi" (es. 500 nanosecondi) maggiore di quando si osserva peptidi (ad esempio 80 nsec). Scegliere l'appropriato intervallo m / z, acquisire gli spettri of la calibrante e calibrare lo strumento. Quando si acquista gli spettri dei vostri campioni, utilizzare l'intensità del laser appropriato (vedi la discussione).

Representative Results

Abbiamo analizzato una proteina intatta (regione cromosomica manutenzione 1 proteina, CRM1; peso molecolare: 123.386 Da) utilizzando due matrici diverse, due metodi di deposizione, e la stessa intensità del laser (Figura 1). SA ed una miscela CHCA_DHB stati utilizzati come matrici. La miscela di prodotto spettri di massa di elevata qualità in termini di rapporto segnale rumore e di sensibilità (Figure 1A e B). In particolare, abbiamo rilevato 0,5 pmoli di proteine ​​depositate sul bersaglio MALDI (Figura 1C). La stessa quantità di proteina era appena rilevabile utilizzando SA (Figura 1D). Inoltre, mediante la miscela matrici, il metodo di scelta per la deposizione di matrice è stato l'approccio "strato sottile" (Figura 1A). Utilizzando il metodo "secco gocciolina", non abbiamo rilevato alcuna proteina con una massa superiore a 100 kDa (dati non mostrati). Utilizzando la miscela CHCA_DHB (Figure 1A e 1C), moltiplicare carica ionica del Protein sono stati osservati, permettendo la determinazione della massa con maggiore precisione perché la risoluzione picco in strumenti MALDI-TOF assiali è inversamente proporzionale alla m / z 26. Abbiamo anche analizzato monomerica beta-galattosidasi (116.300 Da) (Figura 2). Gli spettri CHCA_DHB erano meglio gli spettri SA in termini di sensibilità e risoluzione. Inoltre, la presenza di ioni moltiplicano cariche (M 2 +, M 3 + e 4 + M) ha permesso di confermare la massa della proteina con maggiore precisione (Figure 2A e 2C). Utilizzando l'approccio strato sottile, abbiamo confrontato le prestazioni della miscela CHCA_DHB, SA e solo α-CHCA per l'analisi di una immunoglobulina, IgG (148500 Da) (Figura 3). Quando mettiamo in relazione i diversi dati, segnali di proteine ​​erano più alti e con una migliore risoluzione spettri CHCA_DHB. Per concludere, l'uso della miscela CHCA_DHB e il metodo di deposizione strato sottile dimostrato miglioramenti significativi nella qualità di grande intatta spettri di massa proteica acquisito utilizzando uno strumento MALDI TOF. Figura 1. Analisi MALDI-TOF della regione cromosomica intatta manutenzione 1 proteina, (CRM1), peso molecolare: 123.386 Da. A) 1 pmole di CRM1 è stato analizzato utilizzando il mix DHB_CHCA come matrice B) quantità: 1. Pmole; matrice:. SA C) importo: 0,5 pmole; matrice:. DHB_CHCA D) importo: 0,5 pmole; matrice: SA. Il segnale dei picchi, espressa in una scala in unità arbitrarie di intensità, è normalizzato al valore massimo presente in ogni spettro. pg "src =" / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg "/> Figura 2. Analisi MALDI-TOF intatta beta-galattosidasi (116.300 Da). A) Importo: 20 pmoli; DHB_CHCA matrice B) Importo:. Pmoli 20; matrice:. SA C) importo: 5 pmoli; matrice:. DHB_CHCA D) quantità: 5 pmoli; matrice: SA. Figura 3. Analisi MALDI-TOF di immunoglobuline intatte, IgG (148.500 Da), importo:. 1.7 pmoli Gli spettri ottenuti con la miscela CHCA_DHB erano molto più intense (massima: 8200 unità arbitraria, au) che l'spettri SA (massimo: 1.200 au) e spettri α-CHCA (massimo: 4500 au)

Discussion

Abbiamo presentato un protocollo dettaglio di acquisire spettri di massa di alta qualità di grandi proteine ​​intatte con pesi molecolari superiori a 100 kDa, utilizzando uno strumento MALDI-TOF. Un certo numero di aspetti critici concernenti la preparazione del campione deve essere attentamente valutata al fine di migliorare la qualità degli spettri di massa. Matrici e solventi di elevata purezza sono di importanza critica perché tutti i contaminanti presenti nelle matrici e solventi sono concentrati sul target MALDI dopo evaporazione del solvente. Al fine di migliorare la purezza delle matrici MALDI è possibile purificare utilizzando metodi classici ricristallizzazione (vedi sopra). Si consiglia inoltre di preparare appena le soluzioni matrici (almeno una volta alla settimana) per migliorare la cristallizzazione della matrice e per evitare la degradazione della matrice.

L'approccio deposizione di matrice è molto critica per la qualità finale degli spettri. Come descritto sopra, il metodo strato sottile è il nostro metodo of scelta 12. Inoltre, abbiamo ottimizzato l'approccio per la deposizione del primo strato. Quando la matrice viene sciolto in acetone per ottenere una soluzione satura, il propanone permette veloce evaporazione del solvente, ma anche rende le dimensioni del primo strato molto difficile da controllare. Si consiglia di utilizzare una punta GELoader come poco pennello che si immergere nella soluzione matrix_acetone per ottenere un volume minimo che si deposita rapidamente sul bersaglio. La dimensione del primo strato in qualche modo controlla la dimensione finale dello spot MALDI: un piccolo punto (cioè 0.5-0.75 mm di diametro) è preferibile perché in questo caso la concentrazione del campione è superiore nel caso di una grande macchia. Ottenere un piccolo punto si differenzia da quello strato ultra-sottile precedentemente proposto in un video JOVE 15. In Fenyo et al. Soluzione strato sottile è diffuso in tutto il target MALDI utilizzando il lato di un puntale. Questo approccio richiede testare il sottile strato che dovrebbe soddisfare criteri specifici(Ad esempio la velocità di evaporazione del solvente). Se il criterio non è soddisfatto, il target MALDI deve essere lavato e un nuovo strato sottile deve essere preparato. Questo rende la preparazione abbastanza laboriosa per un novizio. Inoltre, la deposizione della miscela campione / matrice sulla piastra richiede l'aspirazione del solvente in eccesso con una linea di vuoto e una fase di lavaggio con TFA 15 è necessario, rendendo il Fenyo et al. Preparazione un po 'più difficile che il nostro approccio.

Il rapporto in volume tra la matrice ed il campione è molto importante per un'analisi riuscita di proteine ​​intatte mediante MALDI-TOF. Dopo aver testato diversi rapporti si consiglia di utilizzare un rapporto di 1:1. Una matrice diversa: campione proporzione potrebbe compromettere la qualità degli spettri, probabilmente a causa di cristallizzazione disomogenea. L'ordine in cui matrice e del campione vengono depositati è anche critico. Dopo aver depositato lo strato sottile matrice, il campione viene depositato e subito dopo (prima della SAMPLe Spot diventa secca) è aggiunto alla miscela CHCA_DHB. Questa procedura è stata definita come "metodo sandwich" 27, in cui solo il campione viene depositato tra due strati di matrice. In alternativa, la soluzione CHCA_DHB e il campione può essere miscelato in 0,5 ml di tubo e poi macchiato su strato sottile CHCA 12. Questo produce una macchia con uno strato omogeneo di cristalli risultanti in spettri di alta qualità. Nell'analizzare proteine ​​con una massa inferiore a 100 kDa, la concentrazione di DHB può essere aumentata (es. 60:40 DHB: CHCA); questo può produrre più nitida picco, ma potrebbe compromettere la sensibilità di misurazione (ossia picchi meno intensi).

Per una calibrazione dello strumento corretto, è essenziale depositare le norme calibrante molto vicino ai luoghi di esempio, permettendo di ottenere una migliore precisione di massa. A "procedura di calibrazione pseudo-interno" è stato precedentemente suggerito 15: dopo l'acquisizione di uno spettro di esempio, il punto i calibrantes tiro laser e segnale del calibratore sono aggiunti allo spettro del campione. Ciò consente di calibrare internamente lo spettro del campione utilizzando i picchi calibrante.

L'energia laser dovrebbe essere anche attentamente controllata durante l'acquisizione spettri. Nella maggior parte dei casi, maggiore energia aumenta la sensibilità, ma riduce la risoluzione. Si consiglia usando l'energia minima possibile laser senza compromettere la sensibilità dell'acquisizione. Inoltre, per migliorare la qualità spettrale, si può acquisire più tiri su ogni punto del campione. Normalmente i colpi più si acquisisce (1000-2000 colpi), maggiore è l'intensità del segnale. Quando si colpisce il punto con il laser, si ha la necessità di trovare la giusta posizione (cioè "sweet spot"), dal momento che il campione non è omogeneamente distribuita. È possibile sparare sulla stessa area fino a quando il segnale è in aumento, e poi cercare di trovare un'altra area contenente il campione.

In conclusione, elevata purezza di matrici e solvgenitori, i metodi utilizzati per il campione e matrici deposizione sul bersaglio, la posizione degli standard utilizzati per la calibrazione, l'intensità di energia laser, il tempo di acquisizione (numero di scatti / spot) sono fattori critici che si dovrebbe prendere in considerazione quando analizzando proteine ​​intatte da MALDI-TOF MS.

Contributi Autore

LS e EBE progettato gli esperimenti, condotti gli esperimenti di spettrometria di massa, hanno analizzato i dati, e ha scritto il manoscritto.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dott. Christophe Masselon (IRTV, CEA, Grenoble) e membri della infezione virale e del Gruppo Cancro alla IBS, per la loro valutazione critica del manoscritto e per le discussioni utili. Siamo grati a Cyril Dian per il gentile dono della proteina CRM1. Questo lavoro scientifico si è svolto nella struttura spettrometria di massa del Centre Grenoble Istruire (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). E 'stato sostenuto finanziariamente dal Infrastructure francese per Integrated Structural Biology Initiative (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02), GRAL (ANR-10-labx-49-01) [nell'ambito del Partenariato per la biologia strutturale di Grenoble] e il Centro nazionale francese per la ricerca scientifica (CNRS).

Materials

      REAGENTS
Trizma hydrochloride Sigma T3253  
Trizima Sigma T6066  
Micro Bio-Spin 6 chromatography columns Bio-Rad 732-6221  
Vivaspin 500 Sartorius VS0122 various molecular weight cut off
Methanol Fluka 14262  
Ethanol Fluka 02860  
KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers Kimberly Clark 05511  
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich C8982  
Acetone Sigma Aldrich 650501  
2,5-dihydroxybenzoic acid Fluka 39319  
GELoader Tips Eppendorf 0030 001.222  
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998  
Formic acid Fluka 09676  
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031  
Protein Standard II Bruker Daltonics 207234 It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine
Immunoglobulin G ABSciex GEN602151  
      [header]
      EQUIPMENT
Water purifier PURELAB Ultra Analytic ELGA LabWater 89204-052  
Autoflex MALDI-TOF instrument Bruker Daltonics    
MALDI-TOF target Bruker Daltonics    
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Referências

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Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. (79), e50635, doi:10.3791/50635 (2013).
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