Intracellulare di registrazione, sensoriale Campo Mapping, e la coltura neuroni identificata nel Leech, Hirudo medicinalis</i

1. Preparazione di elettrodi e soluzione salina Preparare salina fisiologica e elettrodi prima che l'animale è sezionato. La soluzione di Leech Ringer è costituito dai seguenti: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl 2, KCl 4,0 mM, Tris 10 mM / acido maleico o HEPES. Regolare il pH a 7,4. Preparare un filo di Ag-Cl immergendo un filo d'argento pulito in una piccola quantità di candeggina per 20 minuti o fino a quando il filo ha una finitura liscia grigio scuro. Lavare il filo con acqua distillata prima dell'uso. Quindi, posizionare il filo in un supporto micropipetta che si collega l'amplificatore. Preparare un elettrodo di vetro tagliente di vetro borosilicato con un estrattore pipetta. La resistenza dell'elettrodo dovrebbe essere dell'ordine di 20 mW. Backfill la pipetta con 3 M di acetato di potassio e inserire in nel supporto micropipetta. Per un elettrodo extracellulare preparare una pipetta di vetro tagliente come descritto sopra, rompere la punta indietro distrofinando un altro acuto pipetta vicino al bordo tagliente. Poi il fuoco lucidare la punta in modo che non si strappi i connettivi. Elettrodi extracellulari di plastica potranno anche funzionare finché ci sia un buon contatto tra l'elettrodo e il nervo. Inserire l'elettrodo extracellulare registrazione in un supporto micropipetta (con filo di Ag-Cl) che è dotato di un tubo di gomma e siringa per aspirazione. Usare la siringa per disegnare salina nel elettrodo almeno al livello del filo d'argento. Impostare l'hardware (amplificatore e stimolo isolatore) e parametri di registrazione software seguendo il manuale per l'unità di registrazione segnale specifico. Vedere Leksrisawat et al. 22 per vedere i dettagli sulle apparecchiature utilizzate negli esperimenti descritti di seguito. 2. Ventrale Ganglio Dissection Sezionare la sanguisuga in un grande piatto foderato elastomero di silicone con soluzione di Ringer sanguisuga. Se l'animale è allungata longitudinalmente saràpiù facile rimuovere il cordone nervoso ventrale (vedere Figura 1A). Con # 10 o # 11 dimensioni bisturi, fare una incisione longitudinale con tagli molto superficiali nella linea mediana ventrale. Circa la metà 2/3rd del taglio ventrale è mostrato in Figura 1B. Cercate di non tagliare la calza nera (ventrale seno sangue) fino a quando l'animale è completamente aperto e il seno sangue è allungata senza pieghe. Questo sinusale sangue corre lungo l'animale lungo la linea mediana ventrale. Il VNC è contenuto all'interno di questo vaso sanguigno. Dopo che la pelle è stata tagliata la lunghezza dell'animale usare le forbici iris fine per nick seno sangue (Figura 2). Infilare una lama delle forbici iris belle sotto il seno e sollevare leggermente la lama per separarlo dal tessuto nervoso. Tagliare il seno la lunghezza del VNC evitando le radici nervose, nervi segmentale, o le connessioni tra gangli. Quindi, rimuovere una parte del cordone nervoso ventrale datagliare le radici distali per cui il vaso sanguigno unisce le radici. Ripetere questo processo per ciascun ganglio lungo la lunghezza del cordone nervoso ventrale. Trasferire un segmento di uno o due gangli di una piastra di Petri minore. Il gangli o il singolo ganglio deve essere appuntato teso con un certo gioco. Pin i connettivi e le radici in modo che la guaina ganglio gliale è leggermente allungato per evitare che i corpi cellulari dei neuroni di muoversi quando impalare attraverso la guaina gliale e nel neurone di interesse. I perni devono essere posizionati attraverso il seno nero per le radici e nel mezzo dei due connettivi per minimizzare i danni degli assoni (Figura 3). Porre la capsula Petri con preparato al microscopio e fissarlo con cera sul fondo del piatto per impedire il movimento. Concentrarsi attentamente fascio luminoso utilizzando uno specchio e condensatore luce per vedere i neuroni come nella Figura 4A (schematicamente illustrato in Figura 4B </strong>). Notare le due grandi cellule Retzius nel centro del ganglio. Per effettuare la registrazione intracellulare del Rz, T, P e N neuroni, posizionare accuratamente la punta dell'elettrodo sopra la cella di interesse e delicatamente abbassare la punta fino una fossetta è visto nella guaina gliale. Toccare il titolare elettrodo o manipolatore (con molta attenzione) in modo che la punta dell'elettrodo "pop" nella cella di interesse. Iniettare impulsi brevi (30-40 msec) di corrente positiva (1-10 nA) nella cella di evocare potenziali d'azione. 3. Coltura neuroni del ganglio Preparazione ventrale Pin il lato ventrale gangli in un piatto pulito contenente L-15 con siero di vitello fetale (FCS) (Figura 3). Pin le radici in modo che i gangli sono leggermente allungato come fatto in precedenza per le registrazioni intracellulari. Con forbici pregiati, nick capsula gliale ad una estremità, slip una lama forbici sotto la capsula, poi tagliare la capsula glialecome mostrato in figura 5A. Aggiungere 100 microlitri aliquota di Collagenase / dispasi al piatto e posto su un agitatore per 15 minuti. Esaminare cellule spostando il terreno di coltura attorno ai corpi cellulari esposte. Ritorno alle cellule di shaker per altri 15 minuti o più a lungo fino a quando le cellule escono con aspirazione minima. Utilizzare una pipetta attaccato ad una siringa per estrarre delicatamente le cellule dal ganglio. Fuoco lucidare la punta della pipetta in modo che sia leggermente più grande del diametro del corpo cellulare. Per le cellule Rz in una sanguisuga adulta, il diametro dovrebbe essere di circa 50 micron. Preparare una varietà di pipette con diversi diametri senza filamento, questo diminuisce le probabilità di cellule sporgenti all'interno della pipetta. Conservare le pipette in un flacone contenente 80% di etanolo (EtOH) utilizzando un batuffolo di cotone sul fondo per proteggere le punte da scheggiature. Ricordati di lavare il EtOH fuori della pipetta con il mezzo prima aspirazione cellule. Dopo il trattamento enzimatico, lavare la-enzima contenente terreno con L-15 (con FCS) 2x. Identificare le cellule di interesse e aspirare lentamente nella pipetta tirando la siringa (Figura 6A). Scarico le cellule aspirati in un altro piatto che contiene L-15 (con FCS). Fino ad ora, tutte le procedure erano non-sterile. Effettuare le seguenti operazioni in una cappa sterile. Mettere 3-4 grosse gocce di sterile L-15 (con FCS) in luoghi diversi all'interno di una piastra di Petri sterile. Pipettare le cellule in una delle gocce prima citati, soffiando loro intorno nella goccia per lavarli. Ripetere questo in serie in 3 o 4 gocce di mezzo. Posizionare cellule in una capsula di Petri pulita riempita con L-15 (con FCS). Incubare le cellule per 1-24 ore a temperatura ambiente. Successivamente le cellule pulite possono essere placcati. Lasciando le cellule per poche ore o durante la notte la matrice extracellulare viene via facilmente. Plate subito le celle per generare processi più lunghi. Utilizzare substrato sterile per rivestire un micropozzetti di sh e lasciarlo asciugare completamente (durante la notte), prima coltura esperimenti. Dopo il piatto è stato rivestito, lavare il piatto delicatamente con acqua sterile e poi con una piccola quantità di mezzo L-15. Ricordarsi di utilizzare la soluzione di L-15 senza FCS memo per consentire alle cellule di aderire al piatto. Il terreno può essere leggermente modificata in L-15 con FCS dopo che le cellule hanno aderito al substrato. Se le cellule devono essere utilizzati poche ore dopo la placcatura, poi passare il mezzo di L-15 con FCS non è necessario. Posizionare le cellule accanto all'altro al momento della placcatura di indurre una rapida sinaptogenesi (Figura 6B). Dopo 24 ore provvedimento attività fisiologica in abbinamenti di neuroni. Utilizzare tecniche elettrofisiologiche intracellulari di registrare RP o risposte sinaptiche in coppie in coltura di cellule (stimolare 1 neurone attraverso un intracellulari elettrodi e registrare le risposte dal cellulare accoppiato con un secondo elettrodo intracellulare). title "> 4. Ganglion corpo Preparazione parete Pin il lato sanguisuga dorsale verso il basso in un piatto foderato elastomero come descritto sopra. Pin la pelle di un lato con radici sull'altro lato del ganglio mozzata (Figura 7A, ingrandita nella Figura 7B) o fare una finestra sulla parte ventrale della sanguisuga su un ganglio (Figura 7C) con tutte le radici al corpo muro intatto. Dopo aver ottenuto una registrazione intracellulare stabile in una delle celle sensoriali (T, p, n) utilizzare una piccola bacchetta di vetro che è stato lucidato fuoco a toccare leggermente la pelle nello stesso segmento. Se il neurone che viene registrato è una cella N quindi più pressione dovrà essere applicato sulla pelle. Nella maggior parte dei casi, la cella N risponderà soltanto se la pelle viene pizzicato con le pinzette. Per questo motivo tali cellule dovrebbero essere processati ultimo come si potrebbe danneggiare la pelle o spostare la ricodifica intracellulare disturbando il preparato in un modo. Uno dovrebbe esseregrado di delineare rapidamente la pelle e ganglio con dettagli sufficienti che una mappa di dove si toccato può essere utilizzato per determinare il campo recettivo per un particolare neurone. Dopo la registrazione di come molte cellule T e P il più possibile su entrambi i lati di un ganglio provare le cellule N. Per esaminare se i neuroni sensoriali hanno processi che viaggiano attraverso i connettivi in ​​modo rostrale o caudale e poi le radici nel segmento adiacente alla pelle, le connessioni tra gangli possono essere tagliati e campi recettivi riesaminati per quanto riguarda la diffusione di rilevamento. In sostanza si sta esaminando se vi è stata alcuna perdita nel settore ricettivo. 5. Iniezione tinture fluorescenti Preparare un ganglio sanguisuga come descritto sopra. Riempire un microelettrodo con una soluzione di Lucifero giallo-CH (3,0%) e cloruro di litio (300 mM). Infilzare una delle celle o cellule sensoriali Rz sul lato ventrale del ganglio come descrittosopra. Iniettare colorante nella cella facendo passare corrente negativa (3na) attraverso l'elettrodo per 15 min. Impostare la durata dell'impulso di 100 msec e la frequenza di 2 Hz. Visualizzare i neuroni colorante riempito eccitando il colorante con una lampada al mercurio e un set di filtri FITC / GFP.