Manipulação genética em<em> Δku80</em> Cepas para Análise Genômica Funcional de<em> Toxoplasma gondii</em
Summary
Aqui nós relatamos um método para usar tipo I e tipo II<em> Δku80</em> Estirpes<em> Toxoplasma gondii</em> Para gerar de forma eficiente deleções de genes-alvo e substituições de genes para análise genômica funcional.
Abstract
Targeted manipulação genética utilizando a recombinação homóloga é o método de escolha para a análise genómica funcional para se obter uma visão detalhada da função do gene e do fenótipo da (s). O desenvolvimento de estirpes mutantes com deleção do gene-alvo, as mutações de função do gene alvo, complementado, e / ou genes etiquetados fornece poderosas estratégias para lidar com a função do gene, especialmente se estas manipulações genéticas podem ser eficientemente orientadas para o locus do gene de interesse utilizando integração mediada por duplo atravessar a recombinação homóloga.
Devido às elevadas taxas de recombinação não homóloga, a análise funcional do genoma de T. gondii foi previamente limitada pela ausência de métodos eficientes para a segmentação deleções de genes e as substituições de genes de loci genéticos específicos. Recentemente, foi abolida a principal via de nonhomologous recombinação em tipo I e tipo II cepas de T. gondii, excluindo o gene encodin1,2 g de proteína a Ku80. As estirpes Δku80 comportar-se normalmente durante taquizoíto (aguda) e bradyzoite (crónica) Ciclo in vitro e in vivo e exibem essencialmente uma frequência de 100% de recombinação homóloga. As estirpes Δ Ku80 fazer estudos genómicos funcionais viável no único gene, bem como da escala do genoma 1-4.
Aqui, apresentamos métodos para usar tipo I e tipo II cepas Δku80Δhxgprt para avançar abordagens de segmentação de genes em T. gondii. Nós delinear métodos eficientes para a geração de deleções, substituições de genes, e os genes marcados pela inserção alvo ou exclusão do phosphoribosyltransferase marcador selecionável hipoxantina-xantina-guanina (HXGPRT). O gene alvo protocolo descrito pode ser utilizado numa variedade de maneiras em Δku80 estirpes para avançar a análise funcional do genoma do parasita e para desenvolver estirpes individuais que carregammúltiplo alvo manipulações genéticas. A aplicação deste método de genética e fenotípica subseqüentes irá revelar aspectos fundamentais e únicos da biologia de T. gondii e relacionados com patógenos humanos significativos que causam a malária (Plasmodium sp.) ea criptosporidiose (Cryptosporidium).
Introduction
Toxoplasma gondii é um parasita obrigatório comum protozoário intracelular que freqüência e cronicamente infecta uma grande variedade de animais e seres humanos 5. Estima-se que mais de 1 bilhão de seres humanos são atualmente e cronicamente infectadas pelo patógeno. Em adição à importância da doença causada por T. infecção gondii, a crescente disponibilidade de ferramentas experimentais, poderosos recursos da genômica 6, facilidade de cultivo in vitro e excelentes modelos de ratos fizeram T. gondii um sistema modelo de liderança para o estudo mais amplo de patógenos eucarióticos intracelulares e outros parasitas apicomplexan significativos que causam doenças devastadoras como a malária (Plasmodium sp.) ea criptosporidiose (Cryptosporidium) 5,7. Uma limitação significativa de Toxoplasma gondii como um organismo modelo tem sido a recuperação ineficiente de progênie que transportam alvo de manipulações genéticas. Este problem na segmentação gene é devido a uma baixa frequência de recombinação homóloga em relação à freqüência muito alta de nonhomologous recombinação em cepas do tipo selvagem de T. gondii, mesmo quando uma extensa homologia de ADN é fornecida em moléculas alvo de ADN utilizados em estudos genéticos 2.
Recentemente geneticamente bloquearam a principal via de nonhomologous recombinação em tipo I e tipo II cepas de Toxoplasma gondii, excluindo o gene que codifica a proteína 1,2 Ku80. O tipo I, resultante e Ku80 Δ estirpes de tipo II exibem taxas de crescimento normais, de tamanho e de comportamento tanto in vitro e in vivo e durante taquizoíto fases bradyzoite in vitro e in vivo, no entanto, estas estirpes exibem essencialmente uma frequência de 100% de recombinação homóloga e esta fenótipo aumenta a probabilidade de isolar rapidamente progênie desejada de manipulações genéticas específicas por várias centenas a vários thoUSand vezes 1,2,4. De toda a comunidade uso recente de tipo I e tipo II cepas Δ Ku80 tem significativamente incrementada o ritmo, a variedade, assim como a taxa de abordagens genéticas específicas em T. sucesso gondii 1-4,8-13. Aqui nós descrevemos um protocolo abrangente para eliminação gene alvo, substituição de gene, e marcação gene em Δ Ku80 cepas de T. gondii. Demonstramos como projetar e direcionar de forma confiável as manipulações genéticas de genes específicos ou loci genéticos em Δ Ku80 cepas de Toxoplasma gondii.
Protocol
1. Gene Segmentação excluir um gene de interesse Este protocolo foi concebido para a produção eficiente de uma estirpe mutante que tem uma deleção do gene alvo num locus genético definido. O T. anteriormente descrito gondii hipoxantina-xantina-guanina phosphoribosyltransferase marcador selecionável (HXGPRT) é utilizado neste protocolo para inserção marcador seguro e confiável seguindo ácido micofenólico e xantina (MPA + X) seleção 14-16. Este protocolo utiliza um método validado e de baixo custo para a construção de moléculas de DNA de segmentação com base em levedura clonagem recombinational 17,18. Vários protocolos alternativos estão disponíveis comercialmente para a construção de moléculas de direccionamento de recombinação utilizando métodos de clonagem recombinatória bacterianas, em métodos de clonagem recombinatória in vitro ou PCR de fusão. O protocolo descrito abaixo fornece a mais alta eficiência e confiabilidade de recuperar clonado parágrafosites que possuem uma deleção do gene alvo de Δ Ku80 cepas de T. gondii. 1.1 Preparação de DNA alvo O acesso ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) para obter sequências genómicas para o gene de interesse (GOI). Nota: sequências genómicas deve ser obtido a partir do Tipo I, II ou III na sequência do genoma ToxoDB a base de dados que está mais próxima da estirpe a ser manipulado. Por exemplo: GT1 para RH e ME49 para Pru. Projeto sobreposição primers específicos que amplificam a 5 'e 3' genómicas flancos segmentação do gene de interesse (GOI) que incorpora uma sobreposição de 33 pb com o vector de transporte de levedura pRS416 (ou, alternativamente, pRS426) e incorporar uma sobreposição de 33 pb com o marcador seleccionável ( HXGPRT) (Figuras 1A-B). Adicionar um local de enzima de restrição único em cada um dos iniciadores em ambas as extremidades 5 'de umgenômicas flancos segmentação nd 3 ', colocados entre os 33 pb sobreposição e T. sequência iniciadora específica de Toxoplasma (s) (Figuras 1A-B). Nota: A maior do que 30 bp sobreposição é necessária para a eficiência de clonagem de levedura de recombinação. A 5 'e 3' genómicas flancos de direccionamento são concebidos para amplificar fragmentos de ADN específicos entre 800 e 1400 pb, que definem uma deleção alvo. Esteja ciente de que os flancos mais curtos irá reduzir significativamente visando eficiência no Ku80 Δ Δ hxgprt fundo 2. PCR amplificar a extremidade 5 'flanco alvo utilizando iniciadores F1 e R1, e amplificar por PCR a 3' flanco alvo utilizando o iniciador F2 e R2 (Figuras 1A-C) a partir de ADN genómico 3. Separadamente, amplificar por PCR o gene ~ 2 Kpb HXPGRT incluindo o associado 5 'e 3' de DHFR regiões da caixa 14 HXGPRT pminiHXGPRT ADNc utilizando iniciadores flanqueando HXF e HXR(Figuras 1B-C). Nota: Amplify flancos alvo usando DNA genómico a partir da estirpe parental a ser transfectada. Nota: Colocar o marcador HXGPRT na orientação para a frente em relação à extremidade 5 'e 3' do ADN alvo flancos para facilitar posteriores manipulações genéticas eficientes, tais como a remoção do alvo a partir do locus HXGPRT interrompido. Verifique tamanhos de produtos de PCR por electroforese correctas em gel de agarose e estimar a concentração de fragmento de ADN, utilizando os padrões de gel de agarose ou outro método para determinar a concentração de ADN. Gerar alíquotas leveduras competentes, conforme descrito no Gietz e Schiestly 17. Combine 50 ng de 5 'genómico flanco segmentação, 50 ng de 3' do genoma alvo flanco, com 100 ng do marcador de seleco HXGPRT, e 50 ng de vector de transporte linearizado com H2O esterilizada para obter um volume final de 10 -20 ul. Transforme levedura competente com os três produtos de PCR e levedura E. coli, vector de transporte para a clonagem recombinatória utilizando o protocolo descrito por Gietz e Schiestly 17. Placa de levedura transformada em placas de meio mínimo de agar sem uracilo e incubar a 30 ° C durante 2 – 3 dias. Nota: O conjunto ordenado de plasmídeo, a 5 'flanco alvo, o marcador HXGPRT, e 3' flanqueiam alvo é facilitada pelos 33 pb engenharia sobreposição entre os fragmentos de DNA (Figuras 1A-B) e é mediada pela recombinação homóloga levedura. Colheita de levedura por adição de 2 ml de YPAD 2x às placas sem uracilo e raspando gentilmente para desalojar colónias sem interromper o agar. Centrifugar a solução de levedura, durante 5 min a 5000 x g e eliminar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de levedura em 250 ul de um tampão de ressuspensão contendo com ARNase e adicionar 50-100 ul de umagrânulos de vidro cid-lavados para a solução. Vortex durante 5 minutos à velocidade máxima para esmagar as células de levedura. Permitir que as contas de vidro para assentar no fundo do tubo e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL de Eppendorf. Isolar DNA de levedura utilizando um kit de isolamento de ADN de miniprep, ressuspensão em um volume final de 100 ul ~. Misturar 2 ul de ADN de levedura (~ 50 ng) com 40 ul de DH10B de electroporação competentes E. coli mantidos em gelo. Transferir a solução para um geladas 2 milímetros lacuna e electroporate cuvete de electroporação das células bacterianas, a 2,4 kV e 129 Ω. Células de resgate por adição de 0,8 ml de caldo de SOC a cada cuvete e solução de transferência para um tubo Falcon de tampa de pressão de 14 ml. Incubar as células a 37 ° C num tambor de rolos durante 40 – 60 min. Placa E. coli em placas de ampicilina + 2xYT (Amp) e incubar as placas a 37 ° C durante a noite. Seleccione ~ 6-8 colónias individuais e crescer em 3 ml de 2xYT + AMP durante ~ 16 horas a 37 ° C. <li> Prepare um estoque de glicerol de cada E. congelador 30% clone coli. Isolar pΔGOI plasmídeo de E. clones de E. coli utilizando um kit de miniprep, ressuspensão em um volume final de ~ 100 mL. Validar a pΔGOI usando a enzima de restrição digere para medir o tamanho plasmídeo de DNA e verificar o DNA pΔGOI esperado bandas padrões. Finalize validação de pΔGOI por seqüenciamento de DNA dos 5 'e 3' genômicas flancos segmentação para verificar 100% seqüência de DNA com base em dados da seqüência do genoma em http://www.ToxoDB.org . Nota: nas proximidades de homologia de sequência perfeita é essencial para maximizar a eficiência gene targeting 3 uma vez que cada par de bases diferença constitui um corte correspondente no comprimento de homologia perfeita. Nota: A sequência do genoma da estirpe de tipo II Δku80 baseado no r Pru parentalchuva não está disponível no momento. Este trabalho utiliza o II ME49 seqüência do genoma tipo que o genoma substituto para o II Δ tensão Ku80 tipo. Com base em dados de sequência de um número de loci genéticos, estima-se que o genoma e a ME49 Pru genoma apresentam polimorfismos de nucleótidos a uma frequência de uma por ~ 10.000 nucleótidos, ou menos. Gerar> 200 mg de estoque pΔGOI inoculando a ~ 250 ml 2xYT + AMP cultura durante a noite com os estoques de glicerol a partir de um E. validado coli clone miniprep. Isolar pΔGOI DNA de plasmídeo a partir da cultura grande utilizando um kit de isolamento de ADN maxiprep, ressuspensão em um volume final de 1000 uL ~. Repita as digestões com enzimas de restrição, sequenciação de ADN ou o ADN maxiprep pΔGOI para verificar a molécula de ADN de direccionamento correcto antes da transfecção. Linearizar ~ 15 ug pΔGOI na extremidade 5 'utilizando a enzima de restrição único X (RE.X)local digest embutido no 5 'flanco alvo (Figuras 1B). Nota: Gene alvo em T. gondii requer um mínimo de ~ 10 ug de ADN alvo para obter uma frequência eficiente do alvo eventos no locus do gene de interesse 2. Validar linearização pΔGOI e determinar a concentração de DNA por electroforese em gel de agarose ou por um método alternativo. Nota: Se a digestão com enzimas de restrição nas extremidades 5 'flanco não cede linearização completa, a concebidos 3' único local RE.Y digestão pode ser usado como um sítio alternativo para a linearização da pΔGOI. Nota: Uma molécula de ADN alvo completamente linearizado é essencial para o sucesso do gene alvo através de recombinação homóloga nas estirpes Δ Ku80. Neutralizar a enzima de restrição por incubatmento a 68 ° C durante 15 – 20 min. Preparar pelo menos 15 ug do plasmídeo linearizado em 100 ul de H2O estéril Loja linearizado pΔGOI a -20 ° C até ao momento da transfecção. 1.2 Preparação de T. parasita Toxoplasma, transfecção, seleção, subclonagem, validação de arquivo e manutenção de linhagens geneticamente manipulados Os métodos gerais para a cultura e manipulação de T. gondii em células de fibroblastos de prepúcio humano (HFF) são descritos 19-21. As estirpes Δ Ku80 Δ hxgprt replicar normalmente na forma de infecção parasitária (Eagles Minimal Essential Médium (EMEM) meio de crescimento suplementado com 1% de soro fetal bovino (FBS) e 1%, diluiu-se a partir de um estoque de 100x antimicótica-Antibiótico) 1,2. Todo o trabalho com Toxoplasma gondii deve ser realizada utilizando nível 2 procedimentos de biossegurança. O T. gondii RHΔ Ku80 2 pareestirpe ntal foi gerado a partir da estirpe hxgprt RHΔ do Roos Lab 14. O PruΔku80 uma estirpe parental foi gerado a partir de PruΔhxgprt (Pru gniaud estirpe BSG-4 22), que contém um marcador seleccionável de CAT integrado de forma estável e de uma proteína (GFP), o repórter fluorescente verde sob o controlo da fase bradyzoite LDH2 promotor específico. Inocular frasco de 25 cm2 contendo células HFF confluentes com 1 x 10 6 RH Δ Ku80 Δ hxgprt parasitas viáveis tipo I, ou de inocular dois frascos de 25 centímetros 2 com 2 x 10 6 viável tipo II Prugniaud (Pru) Δ Ku80 Δ hxgprt parasitas. Nota: os parasitas viáveis são definidos como parasitas extracelulares que tenham acabado de lise para fora. Nota: </strong> Esta escala fornece um número suficiente de parasitas viáveis para três experimentos de transfecção. Inspecionar as culturas infectadas Δ Δ Ku80 hxgprt ~ 68-72 horas pós-infecção. Verificar a presença de parasitas viáveis e ~ 90 – 95% de lise de células HFF para planejar o momento preciso de transfecção. Nota: O isolamento de parasitas recém-egressos é essencial para o sucesso deste protocolo porque baixa viabilidade parasita vai abolir a eficiência gene-alvo. Agitar parasitas viáveis em solução, fechando a tampa encaixe vedante num frasco de 25 cm 2 e agitar vigorosamente o recipiente para trás e para agitar os parasitas fora da superfície de crescimento sem derrame de líquidos para o interior da tampa ou o gargalo do balão . Nota: Parasita colheita não exige um protocolo de libertação seringa com agulha para o tipo I ouTipo II Ku80 cepas Δ. Transferir a solução para um parasita seringa de 10 ml ligado a um suporte de filtro contendo uma membrana de 3 um e colocar a unidade de filtro no topo de um tubo de 15 ml com tampa de rosca aberto. Seringa filtrar os parasitas no tubo ml com tampa de rosca 15. Nota: A filtragem dos parasitas através da membrana remove as células infectadas e restos celulares. Determinar a concentração de parasitas (formas taquizoítas por ml), utilizando um hemocitómetro. Nota: Opcional: Utilizando a solução parasita, criou uma unidade formadora de placa (UFP) 21 ensaio que será lido 7-8 dias mais tarde para determinar a viabilidade adequado dos parasitas transfectados (UFP para taquizoíto proporção de ≥ 0,2). Pelota parasitas para 7 min a 1400 xg e aspirar o sobrenadante para ~ 0,4 ml, sem perturbar o parasita pellet. Gire para a 2 min a 1,400 xg e aspirado restante sobrenadante para ~ 0,01 ml, sem perturbar o parasita pellet. Ressuspender o sedimento parasita sacudindo o fundo do tubo e adicione imediatamente tampão cytomix 23 (concentração 1.33x) para o parasita da pelota para obter uma concentração parasita de 4 – 5 x 10 7 cytomix parasitas / mL. Nota: omitir a adição de ATP e glutationa cytomix uma vez que estas adições não melhorar a eficiência do gene targeting. Descongelar a alíquota de 100 ul da linearizado pΔGOI do protocolo 1.1 (passo 26). Transferir 0,3 mL da solução cytomix parasita (~ 1,3-1,6 x 10 7 parasitas) aos 100 ul de linearizado pΔGOI do protocolo 1.1 (passo 26), e transferir imediatamente a totalidade do parasita + 0,4 ml da mistura a uma lacuna pΔGOI refrigeradas 2 milímetros cuvete de electroporação. Electroporate os parasitas em 1,4 kV e 24 Ω. Rest cuvete transfecção à temperatura ambiente durante ~ 5 min, em seguida, transferir todo o conteúdo da cuvete transfecção para um balão de 150 cm 2 contendo células HFF confluentes com 30 ml de meio de infecção e incubar durante a noite a cultura infectada. Comece a selecção em ácido micofenólico + xantina (MPA + X) ~ 20 horas pós-transfecção (Figura 2A), substituindo o meio de infecção com o APM + X meio de selecção (AMF (25 ng / mL) e xantina (50 ug / ml) em infecção média). Nota: Não perturbe o MPA incubação + X frasco seleção. Estimar o número total de PFU no MPA + balão selecção X a 8 dias pós-transfecção, inspeccionando visualmente a monocamada. Verifique a presença de desenvolvimento de zonas de PFU e saudável da infecção por microscopia de luz. Nota: Se as placas não são visíveis de dia 8, manter a seleção e monitorar os sinais de infectarião desde estirpes mutantes podem ter uma taxa de replicação reduzida. Nota: As cepas Δ Δ Ku80 hxgprt parasita tem um baixíssimo fundo de eventos nontargeted indesejáveis, o que permite o isolamento de cepas mutantes com bastante grave, mas defeitos de crescimento não letais. Se um gene que é essencial e não pode ser eliminado, a transfecção primárias, ou subsequentemente passou população de parasitas, podem revelar um fenótipo onde os parasitas deixam de replicar durante a selecção como a população resolve knockouts segmentados. Agitar o frasco como no passo 3 para desalojar os parasitas extracelulares a partir da monocamada [depois placas visíveis desenvolveram] para gerar uma solução parasita. Transferência ~ 0,5 ml da solução de parasita a partir do balão de X + MPA para selecção de 25 cm 2 + MPA balão X selecção contendo células HFF confluentes (designar esta cultura passe 1A). Desalojar parasitas nos 150 original cm 2 + MPA balão X selecção ~ 3 dias mais tarde e transferência ~ 0,5 ml de solução do parasita a um segundo 25 cm 2 + MPA balão X selecção contendo células HFF confluentes (designar esta cultura passe 1B). Permitir que as zonas da infecção se desenvolver em passe 1A e / ou passe para frascos 1B ~ 5 dias. Verificar visualmente por microscopia de luz que passe 1A e 1B frascos contêm um mínimo de 25 PFU viáveis com zonas saudáveis de infecção. Escolha entre o 1A passagem ou frasco 1B passagem para a passagem contínua em MPA + X meio de seleção em 25 centímetros 2 frascos. Manter a passagem sob MPA + seleção X. Nota: Os parasitas devem ser cultivadas por um número suficiente de gerações para excluir epissomas persistentes não integrados a partir da população antes da subclonagem. Não realizar subclonagem antes e 20 dias após a transfecção para o tipo I RH Δ Ku80 Δ hxgprt, ou antes dos 25 dias pós-transfecção paraII Pru Δ Δ Ku80 hxgprt parasitas do tipo para que haja tempo suficiente para diluir episomas não integrados 1,2. Parasitas subclone numa placa de 96 poços contendo células HFF confluentes com MPA + X meio de selecção. Prepare uma bandeja a uma concentração de 1 parasita / poço e uma segunda bandeja a uma concentração de 2 parasitas / poço. Nota: os parasitas subclone que recentemente lisadas (~ 90 – 95% das células HFF em frasco de 25 cm 2), para garantir que os parasitas têm alta viabilidade. Nota: O período de tempo ideal pós-transfecção para subclonagem foi estabelecida medindo a rapidez com que os parasitas-alvo com sucesso surgem em uma alta freqüência na população selecionada 1. Continue a passagem da população primária de parasitas transfectados em MPA + X médio seleção usando uma programação passagem semanal de infectarum balão HFF 25 cm 2 com 10 ul da solução do parasita. Nota: Se os clones que transportam a deleção do gene alvejado (KO) não são obtidas a partir do primeiro passo de subclonagem em 18, resubclone os parasitas da população continuamente mantido ~ 10 – 12 semanas após a transfecção. Nota: Uma das razões para a deleção do gene não é obtido decorre da persistência epissómica de alguns plasmídeos pΔGOI. Persistência epissómico é determinada pelas sequências contidas na direcção 5 'e 3' genómicas flancos de segmentação e não parece surgir do elemento genético HXGPRT. Cerca de 5 – 10% de segmentação plasmídeos apresentam persistência epissómico significativo que necessita de um tempo de subclonagem posterior para permitir que a população de parasitas de um número suficiente de vezes de geração para diluir os epissomas persistentes e resolver a população de integrantes essencialmente estáveis. <ol start = "20"> Pontuação do tabuleiro de 96 poços 6-7 dias após a subclonagem (parasitas do tipo I) ou 7-8 dias após a subclonagem (parasitas do tipo II) para os poços que contêm um único UFP, identificada como uma única zona de infecção em microscopia de luz aos ou 40X 60X ou poder. Marcar um pequeno ponto na tampa de tabuleiro de 96 poços para designar o local da UFP no poço. Misturar os conteúdos de cada poço contendo um único UFP usando uma pipeta fixado em 50 ul (200 ponta ul), orientando o fluxo de fluido ao longo do UFP para dispersar parasitas no poço. Nota: A mistura do parasita também acelera a lise da monocamada HFF. Tipo I cepas RH irá lisar o bem a 4 dias após a mistura, II parasitas Pru tipo vai lisar o bem ~ 5 dias após a mistura. Seleccione uma dúzia lisadas poços (clones) e zero através da parte inferior de cada uma destas cavidades lisadas usando uma 0,5 – 10 ponteira ul simultaneamente puxando-se 6 ml de solução de parasita. Transfer a 6 ml de solução de parasita a uma cavidade num tabuleiro de 24 poços contendo células HFF confluentes em 1 ml de MPA + X meio de selecção. Nota: É essencial para riscar a parte inferior do poço, para manter a abertura do furo da ponta da pipeta em contacto constante com parasitas que residem na parte inferior do poço. Monitorizar o tabuleiro de 24 poços para a lise das células HFF. Nota: Tipo I parasitas RH tipicamente lisar o poço no formato de 24 poços em ~ 4 dias. Tipo II parasitas Pru tipicamente lisar o bem ~ 5 dias. Transferir 2 ul de solução de parasita viável arranhada a partir do fundo de cada poço, no formato de 24 poços para o poço correspondente de um novo tabuleiro de 24 poços contendo células HFF confluentes e 1 ml de MPA + X meio de selecção por poço. Nota: Todos os parasitas clones e linhas pode ser continuamente principalretidos pela passagem 2 ul de solução de parasita viáveis a cada 7 dias neste formato tabuleiro de 24 cavidades. Verifique se os parasitas foram transferidos com sucesso para uma nova bandeja de 24 poços de inspeção visual com microscopia de luz ~ 18 horas de pós-passagem. Colheita parasitas provenientes dos lisados poços do tabuleiro de 24 poços a partir do passo 23-24 utilizando um 1 ml ou 10 ml de uma pipeta e transferir a solução parasita para um tubo Eppendorf. Agregar as parasitas em 1400 x g durante 7 minutos, enxaguar uma vez em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), e pellet novamente a 1.400 x g durante 3 min. Aspirar o PBS do sedimento, em seguida, adiciona-se 200 ul de PBS para o sedimento para ressuspender os parasitas. Congelar a solução parasita a -80 ° C, até o isolamento do DNA. Isolar o ADN do parasita a partir de cada clone utilizando um isolamento minikit ADN do tecido. Validar a deleção do gene alvejado (knockout) por PCR utilizando os iniciadores de validação (Figuras 2A-C). Teste para oausência da região de codificação funcional do gene de interesse utilizando o CxF a montante ea jusante CXR iniciadores de ADN genómico (Figuras 2A-B) de teste para a presença de produtos de PCR que estendem dos flancos alvo genómicos e HXGPRT demonstrar correcta 5 'e 3 'alvo integração do gene HXGPRT no locus do gene suprimido. Nota: Os primers para a validação deve ser exclusivo para o gene de interesse ou a um resultado falso positivo pode ser obtida. O desenho de primers pode ser admitido em http://www.toxodb.org explodindo sequências iniciadoras para o genoma (s) para verificar os iniciadores são únicos. Os clones do parasita passagem num programa semanal tal como descrito no passo 24. Uma vez que a eliminação sistemática foi validado, a seleção continua em MPA + X é opcional. Arquivo parasita clones preparando ações congelador. Pelota parasitas extracelularesa partir de células HFF lisadas em cm garrafa de cultura a 25 2, remova a mídia e delicadamente ressuspender pellet parasita na célula meio de congelamento cultura na concentração parasita> 4 x 10 7 parasitas por ml. Transferir alíquotas para criotubos e armazenar indefinidamente parasitas em azoto líquido ou a -80 ° C. 2. Supressão de HXGPRT Este protocolo é concebido para remover o marcador HXGPRT do seu local de integração no genoma de uma estirpe geneticamente manipulada Δ Ku80. A remoção do HXGPRT permite a recuperação do marcador e a geração de estirpes com múltiplas manipulações genéticas utilizando apenas selecções com base no HXGPRT 1-3. Embora o protocolo detalhado abaixo descreve o método para re-orientar um locus para excluir HXGPRT, deve notar-se que a remoção de HXGPRT no locus do gene de interesse também permite a simultânea de re-integração do gene de tipo selvagem (complementation), a re-integração de um gene mutante, assim como a re-integração de um gene marcado (N-ou C-terminal de GFP, marcador de HA, etc), permitindo uma variedade de manipulações genéticas. Os mecanismos de ação 24 e segmentação protocolos utilizando seleções 6 tioxantina foram previamente descritos 1-3,15. 2.1 Excluir HXGPRT Extirpar o marcador seleccionável de HXGPRT pΔGOI por digestão com RE.Z cortar aos locais de enzimas de restrição únicos flanqueando o HXGPRT (Figura 1B). Verifique a digestão completa do ADN por electroforese em gel de agarose. Isolar a maior das duas bandas do gel de agarose. Nota: A maior das duas bandas contém o plasmídeo, juntamente com a extremidade 5 'e 3' flancos alvo de ADN, mas não o gene HXGPRT. Coloque a secção de agarose contendo a banda de DNA maior em uma coluna de spin deitandog o plano gel sobre a membrana. Girar a coluna a 13.000 x g durante 4 minutos à temperatura ambiente. Adicionar H 2 O esterilizada para o escoamento para levar o volume para 100 ul. Nota: Outros métodos comerciais estão disponíveis para isolar DNA a partir de agarose. Concentrado de DNA por precipitação EtOH, ressuspender o ADN num volume final de 18 ul H2O estéril Mistura-se 1 ul do ADN concentrado com 7 ml de H2O, 1 ul de tampão de ligação 10x e 1 ul de ADN-ligase de T4 (5 unidades) e colocar a reacção a 4 ° C durante a noite para gerar pΔGOIc (pΔGOIclean) (Figura 3A). Nota: Os fragmentos de ADN com extremidades RE.Z contendo ADN podem ser concebidas e incluídos neste passo para criar os plasmídeos adequados para a re-integração específica do gene de tipo selvagem (complementação), orientados re-integração de um gene mutante, bem como orientados re-integração de um gene marcado(N-ou C-terminal de GFP, marcador de HA, etc.) Dilui-se a reacção com 2x estéril H2O antes da electroporação. Transforme pΔGOIc em E. coli como no protocolo de 1,1 a subclonar, isolar e validar o plasmídeo segmentação. Então linearizar pΔGOIc em preparação para a transfecção (veja as etapas 1.1.11 a 1.1.26). Repita o protocolo de transfecção parasita como delineado no protocolo 1.2 (passos 1-11). Nota: Antes de realizar as etapas de 1 a 8, verificar que a remoção alvo de HXGPRT é viável na estirpe mutante. Infect um balão de 2 cm de células HFF confluentes a 150 com 1 x 10 6 taquizoítos da estirpe mutante, utilizando 6-tioxantina (6TX) meio de selecção (200 ug / 6TX em meio de infecção mL) e colocar o balão num ensaio de PFU. Inspecione o frasco de 8 dias mais tarde para verificar se não (ou muito poucos; <10) UFP são visíveis, o que é essencial para estabelecer que o potencial do gene alvo eficiência será superior a qualquer potencial de reversão espontânea da estirpe mutante para um fenótipo com expressão reduzida HXGPRT (um fenótipo de resistência 6TX). Nota: Cerca de 5 – 10% dos sítios de integração HXGPRT exibem uma frequência significativa e espontânea de resistência 6TX embora o marcador HXGPRT ainda está integrado no sítio alvo (ver a secção de resultados representativos para explicação). Comece a selecção 6TX ~ 20 horas pós-transfecção, alterando o meio em frasco com 150 cm 2 para 6TX meio de selecção. Nota: Não perturbe o balão durante ~ 10 dias após a transfecção. Inspeccionar o frasco para a formação UFP no dia 10-12 após a transfecção (parasitas do tipo I) ou dia 10 – 16 após a transfecção (parasitas do tipo II). Nota: Parasites sendo direcionados para a eliminação de HXGPRT não vai começar a crescer sob seleção 6TX até que o gene HXGPRT e mRNA é excluído, ea proteína HXGPRT residual é inativado. Agitar o frasco de selecção para criar uma solução de parasita, e transferência de 0,5 – 1,0 ml da solução para um novo parasita balão de 25 centímetros 2 contendo células HFF confluentes e 5 ml de meio de selecção 6TX. Repita a transferência do primário 150 centímetros de 2 a 25 centímetros dois novos balões, uma vez por dia, durante mais dois dias. Nota: amostragem múltipla aumenta as chances de capturar parasitas viáveis alvo que perderam o gene HXGPRT. Inspeccionar os 25 cm2 frascos ~ 5 dias após a infecção para verificar a presença de desenvolvimento de PFU com zonas de parasitas replicam saudáveis. Escolha um ou dois balões contendo as zonas da infecção. Nota: </sTrong> Parasitas excluídos da réplica gene HXGPRT a uma taxa de crescimento normal na seleção 6TX. Continue a passagem dos parasitas em meio a seleção 6TX. Subclone a população de parasitas após 25-30 dias de selecção. Configurar uma bandeja de 96 poços com ~ um parasita / bem e outro com ~ 2 parasitas / poço. Preparar DNA de parasita a partir de clones isolados e mantêm uma cultura de clones em formato de 24 cavidades de acordo com o protocolo 1.2 (etapas 19 a 29). Validar exclusão de HXGPRT por PCR usando a estratégia delineada nas Figuras 3A-B. 3. Marcação de C-terminal de Proteínas Este protocolo é concebido para C-terminal de marcação de proteínas, visando a etiqueta para a integração através de cross over duplo recombinação homóloga no locus genómico do gene utilizando MPA + X selecção 2,4. Este protocolo funciona de forma eficiente, porque a extremidade 5 'da sequência de dhfr <em> HXGPRT marcador é uma região 3 'não traduzida funcional totalmente validado para outros genes 2,4. 3.1 marcação directa C-terminal de proteínas de loci genéticos endógenos Criar segmentação pΔGOItag construção de plasmídeo de levedura utilizando clonagem recombinatória (Figura 4) e os métodos descritos no protocolo 1.1. A 5 'genómico flanco segmentação contém os últimos 800 a 1200 pb da região de codificação (ou ADN genómico) do GI, excepto o codão de terminação é movido para uma posição 3' para a marcação de escolha (HA tag, Myc His , etc) Criar a inserção orientada de a etiqueta C-terminal no locus endógeno do gene que codifica a proteína, seguindo os passos do protocolo 1.1 e 1.2, utilizando a estratégia descrita (Figura 4). Verifique a inserção da etiqueta C-terminal no locus do gene endógeno através de uma estratégia de PCR. Redirecionar o locus do gene usando métodos descritos no protocolo 1 e 2 do protocolo de dElete o marcador seleccionável HXGPRT para criar um locus do gene endógeno precisamente regulado que expressa uma proteína marcada. Este protocolo recupera também a HXGPRT marcador seleccionável que pode ser utilizado novamente para atingir um outro lugar na estirpe marcada (ver protocolo 1).
Representative Results
Um molde detalhada é fornecida para a construção de um plasmídeo de direccionamento para eliminar um gene, incluindo a colocação de locais de enzimas de restrição e geração dos iniciadores que facilitam a segmentação genética e validação do gene alvo, bem como a construção do plasmídeo para a eliminação subsequente do HXGPRT numa processo de uma só etapa (Figuras 1A-C, Figura 2A, Figura 3A). Um esquema geral é apresentado para fazer uma deleção do gene alvo (Figura 2A), os pares de iniciadores utilizados para validar a supressão de um nocaute, por exemplo, tipo I ROP18 (Figura 2B), e os resultados representativos da validação de PCR estão mostrados (Figura 2C). Este resultado representativo é mostrado para ilustrar a gama de resultados que podem ser obtidos nos loci genéticos que são relativamente difíceis de atingir. A deleção do gene alvo com sucesso irão resultar na ausência do gene emteresse produto de PCR (PCR 1), a presença da extremidade 3 'do genoma alvo flanco (pCR2), e a presença do marcador seleccionável HXGPRT adequadamente integradas entre as extremidades 5' e genómicas flancos segmentação 3 'que definem a deleção (PCR3 e protocolo PCR4) . Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 e 11 são validados deleções de genes alvo (nocautes), onde HXGPRT substituiu o GOI (Figura 2C). Um clone que não contém uma deleção do gene pode ser representado por uma variedade de padrões de bandas. Tipicamente, um clone sem uma deleção do gene irá espelhar a estirpe parental (padrão dos pais) com bandas observadas por PCR1 e pCR2, mas não para PCR3 ou protocolo PCR4 como visto para os clones 1 e 2 (Figura 2C). Este "padrão parental" surge a partir de alguns mecanismos potenciais. Ocasionalmente, parasitas resistentes selecionados MPA realizar não integrados episomas persistentes do pΔGOI segmentação plasmídeo, e notamos que a seleção continuada muitas vezes obriga esses episomasintegrar. Observamos, também, algum fundo rara do tipo I Δ estirpe Ku80 devido a integração não intencional do pΔGOI plasmídeo de direccionamento, que contém um cDNA HXGPRT expressa através de DHFR 5 'e 3' elementos promotores, em qualquer locus DHFR ou para a HXGPRT parcialmente suprimida lócus 14. Embora este evento raro é uma integração alvo, não foi a integração pretendida e serve como um ponto chave para se lembrar na criação de qualquer estratégia de substituição de genes. Homologia DNA superior a 120 bp realizadas em seu pΔGOI alvo plasmídeo pode fornecer um local alternativo para a recombinação em Δ cepas Ku80 dois que poderiam dar para trás um fundo indesejado. Na Segunda Pru Δ estirpe do tipo Ku80 este fundo é reduzido ou inexistente comparativamente ao tipo I porque o marcador seleccionável HXGPRT é baseada no tipo I que possuem sequências nucleotídicas polimorfismos quando comparados com o ADN do tipo II quereduz significativamente este cenário raro em experimentos usando o tipo II Pru Δ Ku80 tensão 1. Se um locus genético é essencial (não pode ser excluído), ou tem um gene extremamente baixa alvo de freqüência no local, ou se persiste [não integrado] episomas não são facilmente eliminados através do crescimento e seleção, este padrão parental vai dominar o padrão observado em MPA os clones resistentes. Alternativamente, a molécula de ADN de direccionamento é por vezes observado para integrar a apenas a extremidade 5 'ou 3' do genoma alvo flanco e de uma banda é observada tanto para PCR3 ou protocolo PCR4 (mas não ambos), juntamente com PCR1 pCR2 e como pode ser visto para o clone 10 (5 "integração) e clone 7 (3 'integração) (Figura 2C). Estes padrões sugerem a ocorrência frequente de um único cruzamento sobre a integração do plasmídeo de direccionamento no locus que integra HXGPRT mas essa integração alvo não exclui o gene de interesse. Este padrão (faixas 7 e 10 na Figura 2C) EMphasizes a necessidade de comunicar dados de PCR para verificar a integração alvo que ocorreu em vez de um único atravessar homólogo e mais de um segundo integração não homóloga da molécula de alvejamento. Raramente, observamos uma mistura genética representada pelo clone 12 (Figura 2C), que representa tanto um padrão parental e um padrão de eliminação sistemática. Este padrão mais provável surge na ocasião a partir de dois genótipos de parasitas que se encontram presentes no mesmo local, em um clonagem bem. Um esquema geral para a remoção de HXGPRT de Δ ku80Δgoi :: HXGPRT excluir HXGPRT na estirpe é mostrado (Figura 3A). O par de primers utilizados para validar a remoção de HXGPRT de Δ Δ Ku80 gra2 :: HXGPRT (Figura 3B) amplifica a ~ 1,2 Kbp banda única no PCR5 como visto em clones 4, 7, 9, 11 e 12 (Figura 3C). Se HXGPRT não é removida do local, a ~ 3.4 Kbp banda é observada (clones 1, 2, 3, 6, 8, 10, eo controle parental). Vários mecanismos actuar para fazer a remoção do HXGPRT (6TX selecção) mais difícil e menos eficiente do que a integração de HXGPRT (MPA + X selecção). Selecção de MPA é simplesmente mais eficiente do que 6TX selecção 14,16. Além disso, são necessários níveis mais elevados de expressão de selecção HXGPRT 6TX que para selecções MPA 16,24. Consequentemente, as mutações que podem reduzir a atividade enzimática HXGPRT ou mutações ou alterações epigenéticas que reduzem o nível de HXGPRT expressão em lugar de um gene pode, potencialmente, eliminar a eficácia da seleção 6TX. Mesmo com estes desafios de selecção 6TX, a taxa de selecção em estirpes 6TX Δ Ku80 sucesso é superior a 90% na primeira tentativa 1-3. Um esquema geral para a direta marcação C-terminal de genes codificadores de proteínas é mostrado (Figura 4). Esteesquema usa a integração directa através cruz dupla recombinação homóloga ao longo de HXGPRT 3 'do gene marcado e também emprega estratégias de validação semelhantes aos descritos acima. Quando se suspeita que um gene seja um gene essencial este pode ser verificado através de uma segunda transfecção com um alvo de DNA de plasmídeo isolado de forma independente. Métodos alternativos, tais como esquemas de expressão gênica regulada, estão disponíveis para posterior verificação se um gene é essencial 25. Figura 1. Resumo do desenho de um ADN plasmídeo de direccionamento. A. Esquemática para a concepção de sobreposição primers utilizados para PCR amplificar a 5 'e 3' flancos alvo com 33 sobrepõe pb para o transporte vetor e cassete minigene HXGPRT pRS416. Os iniciadores descritos no esquema foramusado para gerar a extremidade 5 'e 3' flancos alvo de pΔROP18 10. B. Estratégia geral para a concepção de uma molécula de ADN alvo. A espinha dorsal da pΔGOI é o pRS416 shuttle vector contendo uracila (URA) e ampicilina (AMP) marcadores selecionáveis. Inserido em pRS416 é um ~ 1 Kbp 5 'do ADN flanco alvo amplificado a partir de ADN genómico com sobreposições para a cassete de minigene HXGPRT pRS416 e utilizando os iniciadores F1 e R1, um ~ 1 kpb 3' do ADN flanco alvo é amplificado a partir de ADN genómico com sobreposições para a cassete de minigene HXGPRT e pRS416 utilizando os primers de F2 e R2 e da cassete de minigene HXGPRT. Os seguintes locais de digest de enzimas de restrição únicos são adicionados aos iniciadores: RE.X (local de corte da enzima de restrição X), no iniciador F1 para cortar o plasmídeo na extremidade 5 'da região 5' do DNA alvo flanco, RE.Y no R2 iniciador para cortar o plasmídeo no 'final da extremidade 3' do ADN de 3 flanco RE.Z alvo e os iniciadores em R1 e F2 para excisar a HXGPRT minC. seqüências Primer cassete igene. usados para gerar a construção visando a supressão de ROP18. As regiões em negrito correspondem a T. gondii sequência genómica e as regiões nonbold correspondem aos locais de enzimas de restrição e as sequências que se sobrepõem com a cassete e pRS416 minigene HXGPRT. O HX_F e HX_R par de primers amplifica a cassete minigene HXGPRT 14. Os iniciadores ler de 5 'para 3'. Tabela adaptada de Fentress et al 10. Clique aqui para ver a figura maior . Figura 2. Visão geral do protocolo para a supressão de um gene usando HXGPRT. A. Disruption de um GOI na estirpe ku80Δhxgprt Δ por um duplo evento de recombinação homóloga cruzado utilizando um ~ 1 Kbp 5 'do DNA-alvo e um flanco ~ 1 kpb 3' do ADN alvo no flanco pΔGOI plasmídeo. A estratégia de PCR utilizando PCR1, pCR2, PCR3 e protocolo PCR4 (não à escala) é mostrado que possibilite a verificação genótipo para validar clones específicas de integração de HXGPRT e exclusão do locus GOI. B. pares de primers Representante projetado para validar a supressão da ROP18 . ROP18_DF e ROP18_DR amplificar PCR1, ROP18_ExF e ROP18_CxR amplificar pCR2, ROP18_CxF e DHFR_CxR amplificar PCR3 e DHFR_CxF e ROP18_CxR amplificar protocolo PCR4 (ver Figura 2A). Os iniciadores ler de 5 'para 3'. Tabela adaptada de Fentress et al 10. C. Os resultados representativos de validação de uma deleção do gene alvo (ROP18) usando HXGPRT. Após transfecção de plasmídeo pΔROP18 em Δ ku80Δhxgprt e seleção em MPA +X, MPA + X clones resistentes foram analisadas para a exclusão de ROP18. Cepa parental O controle é positivo para PCR 1 (~ 400 pb) e PCR 2 (~ 650 pb) do produto e negativo para a PCR 3 (~ 1200 pb) e PCR 4 (~ 1300 pb) do produto. Um nocaute GI alvo é positivo para os produtos pCR2, PCR3 e protocolo PCR4 e é negativo para o produto 1 da PCR (ver Figura 2A). São mostrados painéis representativos dos resultados da PCR1 e pCR2 (painel superior), PCR3 (painel do meio) e protocolo PCR4 (painel inferior). Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 e 11 apresentam o padrão de bandas correto de PCR 1, pCR2, PCR3 e protocolo PCR4 que define um evento de deleção do gene alvo no clone. Clones 1, 2, 7, 10 e 12 não são deleções de genes, e correspondem a outros potenciais resultados representativos. (C = tensão de controlo parental Δ ku80Δhxgprt, M = marcadores de tamanho). Clique aqui para ver a figura maior . Figura 3. Visão geral do protocolo para a re-segmentação do gene de interesse para excluir HXGPRT. A. Estratégia para a remoção do marcador de selecção HXGPRT por um duplo evento de recombinação homóloga passagem na estirpe Δ ku80Δgoi :: HXGPRT utilizando um ~ 1 Kbp 5 'do DNA-alvo e um flanco ~ 1 kpb 3' do ADN alvo no flanco pΔGOIc plasmídeo. A estratégia de PCR para verificação genótipo é descrita usando um par de iniciadores de ensaio para um produto de PCR (PCR5) que se estende a deleção (sem escala). B. Um par de primers representativa destinada a validar a remoção do marcador seleccionável HXGPRT do gra2 lócus de tensão Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primers GRA2 _CLF e GRA2_CxR amplificar PCR5. Primers ler a partir de 5 'para 3' do painel. C. Representante da 6TX clones resistentes que podem ser obtidos seguinte pΔGOIc transfecção de plasmídeo em Δ ku80Δgoi :: HXGPRT e seleção em 6TX. Os clones 4, 7, 9, 11 e 12 apresentam o padrão de bandas do PCR5 correcta que corresponde à deleção alvo do marcador HXGPRT (~ 1,2 Kbp do produto que se estende »flanco com ligeira sobreposição com a extremidade 5 'do flanco 3 e fora da 3' flanco). Os clones 1, 2, 3, 6, 8, e 10 (esta banda é leve) representam o padrão de bandas previsto de cerca de ~ 3,4 kpb, que corresponde ao clone de genótipo parental, embora estes clones exibiram um grau de resistência ao 6TX que permitiram sua seleção (este fenótipo, ocasionalmente, pode surgir espontaneamente por desligamento de expressão HXGPRT (ver nota no protocolo 2.1 (etapa 8) e seção Resultados Representante). (C = tensão de controlo parental Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = marcadores de tamanho).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver a figura maior. Figura 4. Desenho de uma molécula de ADN alvo para marcar a extremidade C-terminal de uma proteína. A estratégia baseia-se na capacidade do marcador HXGPRT para também funcionar como um iniciador 3 'a região reguladora a jusante. A espinha dorsal da pΔGOItag é o pRS416 transporte vetor contendo uracila (URA) e ampicilina (AMP) marcadores selecionáveis. Inserido em pRS416 é um ~ 1 Kbp 5 'do ADN flanco alvo amplificado a partir de ADN genómico com sobreposições para a cassete de minigene HXGPRT e pRS416 usando o Fgoi e rtag iniciadores, um ~ 1 kpb 3' do ADN flanco alvo é amplificado a partir de ADN genómico com sobreposições para a cassete de minigene HXGPRT e pRS416 usando o F2 e R2primers ea cassete minigene HXGPRT. A 5 'do ADN alvo flanco substitui o codão de terminação com a marca (HA, Myc, His, etc), seguida por um codão de terminação da substituição. MPA + X selecção integra a etiqueta C-terminal e um HXGPRT jusante, e move a UTR 3 'para uma posição na sequência do marcador HXGPRT. Os seguintes locais de digest de enzimas de restrição únicos são adicionados aos iniciadores: RE.X (local de corte da enzima de restrição X), no iniciador Fgoi para cortar o plasmídeo na extremidade 5 'da região 5' do DNA alvo flanco e no RE.Y R2 primer para cortar o plasmídeo no 'final da extremidade 3' do flanco 3 ADN alvo, e RE.Z no rtag iniciadores e F2 para excisar o minigene HXGPRT cassete para uso na construção de plasmídeo de re-orientar o locus do gene marcado para eliminar o marcador HXGPRT que irá restaurar o posicionamento da UTR 3 '.
Discussion
Aqui nós fornecemos um protocolo eficiente para o gene alvo em Δ Ku80 linhagens do parasita para permitir a recuperação eficiente de descendentes geneticamente manipulados que possuem deleções de genes-alvo, substituição de genes e / ou genes marcados. A execução sequencial destes métodos proporciona uma abordagem fiável para o isolamento de mutantes que contêm parasitas manipulações genéticas específicas únicas ou múltiplas 1-3. Embora a geração de uma deleção alvo depende de múltiplos factores, a utilização da estirpe Δ Ku80 com a estratégia apresentada protocolo e aumenta grandemente a facilidade e eficiência de fazer precisamente definidos estirpes mutantes de T. gondii para estudos de genômica funcional.
O genoma de T. gondii durante as fases assexuadas é haplóide. Assim, uma consideração a fazer quando se pretende eliminar um gene é o gene que não deve ser essencial in vitro. No entanto, a eficiência da tarjating nocautes genéticas em linhagens Ku80 Δ é extremamente alta, e isso permite o isolamento de cepas mutantes com taxas de replicação prejudicada significativamente. Se o alvo é um gene essencial, parasitas muitas vezes deixam de se replicar no decurso da selecção. Outro factor crítico na manipulação genética alvo é que perfeita homologia com pelo menos 620 pb do flanco genómico alvo é necessária para obter detectáveis integrações orientadas 2. Regiões mais longos de homologia produzir maiores eficiências de segmentação e segmentação usando os flancos de DNA de aproximadamente 1.000 bp é um método confiável e eficiente 1-4. Por esta razão, é importante que genómicas flancos de direccionamento são gerados a partir da mesma estirpe de T. gondii (RH, Pru) como a estirpe que está a ser geneticamente manipulados. Falta de homologia suficiente pode freqüentemente resultar na integração alvo de um flanco alvo genômico, mas não o outro. Integração incompleta ou falha para obter uma ma nocautey também ser devido à persistência episomal. Imediatamente após a transfecção, todas as moléculas de direccionamento são epissomas não integrado, e moléculas de direccionamento, por vezes pode persistir como epissomas, por muitas gerações. Usando flancos DNA alvo de ~ 1 Kbp e continuar a passar os parasitas sob seleção antes de re-subcloning freqüentemente resolve problemas associados com a persistência episomal.
Uma vez que um nocaute é validada e o marcador HXGPRT é removido, a estratégia do gene alvo pode ser repetido com uma segunda GI para gerar deleções de genes múltiplos numa única estirpe de parasita 1-3. A geração de deleções, substituições, ou genes etiquetados pode também ser conseguida por meio de diferentes marcadores seleccionáveis (bleomicina, CAT, DHFR resistente a pirimetamina, etc.) Embora o marcador de selecção CAT actualmente está presente no tipo II Δ Ku80 Pru um genoma, este marcador pode ser removido usando a HXGPRT </em> protocolo de selecção descrito aqui. Em nossas mãos, a seleção HXGPRT é o mais seguro eo marcador mais eficiente, com a maior eficiência visando onde uma única cópia de inserção alvo é suficiente para a seleção robusta em MPA + X médio. HXGPRT também fornece a única abordagem atualmente útil para eliminação sistemática de um marcador seleccionável (Figura 3) utilizando 6-tioxantina (6TX) selecção 2,3. Assim, este protocolo constitui a única abordagem atual para o desenvolvimento de cepas mutantes definidos com diversas manipulações genéticas específicas.
Este protocolo proporciona um método valioso e eficiente para a manipulação genética alvo em Δ Ku80 estirpes de T. gondii e é aplicável à análise de um único gene, uma família de genes, ou em estudos genómicos funcionais do genoma completo. Antes da disponibilidade de Δ Ku80 estirpes 1,2, estas abordagens não foram amplamente viável devido à inefficiency destes métodos. Consequentemente, este protocolo é amplamente aplicável para a manipulação genética específica de Toxoplasma gondii e é acessível a todos os investigadores interessados em abordar uma série de questões sobre biologia parasitária, a resposta do hospedeiro e genômica funcional.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por concessões do NIH para DJB (AI041930, AI073142, AI075931 e AI091461).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Overlap Primers | Integrated DNA Technologies | 4 nmole Ultramer DNA oligos | |
| Validation Primers | Integrated DNA Technologies | 100 nmole DNA Oligo | |
| Yeast Strain #90845 | ATCC | Designation FY834 | |
| Shuttle Vector pRS416 | ATCC | 87521 | |
| DH10B E. coli | Invitrogen | 12033-015 | SOC broth in kit with E. coli |
| Resuspension Buffer | Qiagen | Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
| Glass Beads | Scientific Industries | SI-BG05 | 0.5 mm acid-washed |
| Qiacube Automated Robotic Work Station | Qiagen | ||
| Electroporation Cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | 2 mm-gap |
| BTX600 electroporator | BTX | ||
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12662 | QIAprep Spin Maxiprep Kit |
| 25 cm2 Canted neck plug seal flask | Corning | 430168 | |
| 150 cm2 Canted Neck plug seal flask | Corning | 430823 | |
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | ATCC | SCRC1041 | |
| Swin-lok Filter Holder | Whatman | 420200 | 25-mm-diameter |
| Membrane | Whatman | 110612 | Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter |
| Mycophenolic acid (MPA) | Sigma | ||
| Xanthine (X) | Sigma | ||
| 96-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
| 24-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
| MEM Eagle Media | Lonza Biowhittaker | 12-611F | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-111 | |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Spin Column | Primm Labs | PAE-100 | Easy Clean DNA Extraction Spin Kit |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | ||
| 6-thioxanthine | Acros Organics | ||
| Tissue DNA Minikit | Qiagen | 51104 | QIAamp DNA Blood Mini Kit |
| Cell Culture Freeze/Recovery Media | Gibco | 126-48-010 | |
| Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30028.02 | minus calcium, minus magensium |
Referências
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Rommereim, L. M., Hortua Triana, M. A., Falla, A., Sanders, K. L., Guevara, R. B., Bzik, D. J., Fox, B. A. Genetic Manipulation in Δku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (77), e50598, doi:10.3791/50598 (2013).