Transplantasjon av Olfactory Ensheathing Cells å evaluere Funksjonell Recovery etter perifer nerveskade
Summary
Lukte ensheathing celler (OECs) er neural crest cellene som tillater vekst av de primære olfactory nerveceller. Denne spesielle egenskapen kan brukes til celletransplantasjon. Vi presenterer her en modell for celletransplantasjon basert på bruk av OECs i et laryngeal nerveskade modell.
Abstract
Lukte ensheathing celler (OECs) er neural crest cellene som tillater vekst og gjenvekst av de primære olfactory nerveceller. Faktisk er den primære luktsystemet kjennetegnes ved sin evne til å gi opphav til nye nerveceller, selv i voksne dyr. Denne spesielle evne er delvis på grunn av tilstedeværelsen av OECs som skaper et gunstig mikromiljø for neurogenesis. Denne egenskapen av OECs har vært brukt for cellular transplantasjon for eksempel i ryggmargsskade modeller. Selv om det perifere nervesystemet har en større kapasitet til å regenerere etter nerveskade enn det sentrale nervesystemet, komplette seksjoner indusere misrouting ved aksonal gjenvekst i særdeleshet etter ansikts av strupenervetranseksjon. Nærmere bestemt, full seksjonering av tilbakevendende strupehodet nerve (RLN) induserer avvik axonal gjenvekst som resulterer i synkinesis av stemmebåndene. I denne spesifikke modellen, viste vi at OECs transplantasjon effektivt øker aksonal gjenvekst.
ve_content "> OECs utgjøres av flere subpopulasjoner som er tilstede i både den olfaktoriske mucosa (OM-OECs) and olfactory pærer (OB-OECs). Vi presenterer her en modell for celletransplantasjon basert på bruken av disse forskjellige subpopulasjoner av OECs i en RLN skademodell. Ved hjelp av dette paradigmet, ble primærkulturer av OB-OECs og OM-OECs transplantert i Matrigel etter seksjon og anastomose av RLN. To måneder etter operasjonen, vi evaluert transplanterte dyr ved supplerende analyser basert på videolaryngoscopy, elektromyografi (EMG) og histologiske undersøkelser. Først videolaryngoscopy tillot oss å evaluere laryngeale funksjoner, spesielt muskel cocontractions fenomener. Deretter analyser EMG demonstrert fylde og synkronisering av muskel-aktivitet. Endelig histologiske studier basert på toluidin blå farging tillates kvantifisering av antallet og profilen myelinerte fibre.Alle sammen, beskriver vi her hvordan du isolerer, kultur, vederbukntify og transplantasjon OECs fra OM og OB etter RLN seksjon-anastomose og hvordan man skal vurdere og analysere effektiviteten av disse transplanterte cellene på aksonale Etterveksten og strupe funksjoner.
Introduction
Den primære luktsystemet er sammensatt av to distinkte deler; lukte mucosa (OM) i det perifere nervesystemet og luktelappen (OB) i det sentrale nervesystemet. Den primære luktsystemet er preget av kapasiteten på de primære olfactory nevroner (PON) til selv fornye hele livet i pattedyrarter. Denne evnen er gjort mulig på grunn av tilstedeværelsen av nevrale stamceller i OM. PON vekst og gjenvekst fra OM til OB er tilrettelagt av spesialiserte gliaceller kalt lukte ensheathing celler (OECs). OECs er neural crest cellene som skaper et gunstig mikromiljøet for neurogenesis av PON fra OM til OB ett. Derved kan OECs bli funnet i OM og i OB som utgjør forskjellige subpopulasjoner av celler 2,3. De ulike egenskapene til OECs har ført forskere til å bruke dem for mobilnettet transplantasjoner i flere nervesystemet lesjon paradigmer fire. Faktisk OECs produsere vekstfaktorer, redusere glial scaring, prOmote axonal gjenvekst, og kan fritt blande seg med astrocytter 5,6. Imidlertid er det store flertallet av disse studiene basert på ryggmargsskade (SCI), noen av dem har brukt OECs etter perifer nerveskade (PNI) 7,8.
Selv om det perifere nervesystemet har en stor kapasitet til å regenerere etter nerveskade, komplette seksjoner indusere avvik aksonal gjenvekst. Faktisk, etter komplette transections av ansikts-eller tilbakevendende strupehodet nerver (RLN) sendt feil axons forårsake muskel cocontractions kalt synkinesis. Derfor er det av avgjørende betydning å foreslå en modell av PNI å ikke bare tallfeste axonal gjenvekst, men også for å evaluere effektiviteten av muskelsammentrekninger. I litteraturen er det mest vanlige modellen er beskrevet er basert på ansiktsnerven lesjon 9,10. I denne modellen er funksjonelle evalueringer basert på utvinning av whisker bevegelser 10. Men det er vanskelig å demonstrere effektiviteten av movements og å diskriminere de muskuløse cocontractions fenomener. Vi foreslår her en modell basert på en RLN lesjon. Denne modellen gjør det mulig å evaluere ikke bare axonal gjenvekst og bevegelser av stemmebåndene, men også effektiviteten og funksjonaliteten til disse bevegelsene etter cellulære transplantasjoner 11,12. Denne protokollen gir en trinnvis fremgangsmåte til kultur og transplantasjon OECs fra OM og OB i en RLN seksjon / anastomose modell og å evaluere dyr etter operasjonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikkene som presenteres her gjør OECs en nyttig modell for å studere cellulære transplantasjoner i perifere nerveskader modeller. Cellekultur-protokollen er relativt enkel og kan lett utføres. På den annen side, kirurgiske inngrep, spesielt punkt / anastomose av RLN, krever erfaring og må utføres av fagfolk.
Prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen markere viktige faktorer for å fokusere på for å oppnå best mulig resultat. Først under dissosiasjon av OM, anbefaler vi f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Adir (Aide à Bosted aux Insuffisants Respiratoires) og Fondation de l'Avenir for deres økonomiske støtte og til Dr. Fanie Barnabé-Heider for redigering av manuskriptet.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T |
| FBS | Invitrogen | E3387M |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 |
| DDSA | BIOVALLEY | 00563-450 |
| MNA | BIOVALLEY | 00886-450 |
| BDMA | BIOVALLEY | 00141-100 |
| POLYBED 812 | BIOVALLEY | 08791-500 |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 |
| Toluidine Blue | RAL DIAGNOSTICS | 361590-0025 |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK |
| Incubator | Thermo scientific | |
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur |
| Microscope | Zeiss | |
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 |
| Acquisition system | ADInstruments | Powerlab system |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
Referências
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
