Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

1. Nick Çeviri tarafından Doğrudan Etiketli DNA Probları oluşturma Not: BAC'ler yapılmış Doğrudan etiketli sondalar (100-250 kb) sürekli parlak sinyalleri üretmek. Küçük prob gerekiyorsa, 5-10 kb ekler içeren fosmids (40-50 kb) ya da plazmid kullanın. BAC veya Ensemble veya UCSC genom tarayıcıları kullanarak belirli genlerin karşılık fosmid klonlar belirleyin. Tekrar yağış tarafından yüksek kaliteli BAC DNA hazırlayın veya ticari kitleri kullanın. Daha az hazırlık bakteriyel genomik DNA ile kontamine olduğu, daha az prob slayt başına gereklidir. Iki adımda etiketleme gerçekleştirin: nick çeviri aminoallyl-dUTP ve bir amin-reaktif boya kimyasal bağlantı tanıtmak. 1.1. Nick Çeviri Nick translation sırasında, DNaz I, tek telli ara oluşturmak için kullanılır. DNA Polimeraz Ben yeni, t mevcut nükleotid yerine, rumuz '' Bunların uçları '3 uzar burada 'tercüme' nick ve böylece işaretlenmiş nükleotidlerin dahil fırsatı sağlar. Aminoallyl-dUTP DNA Polimeraz I ile nedeniyle verimli esas seçilir I ve amin-reaktif boyalar ya da haptenler daha sonra kimyasal bağlanma için potansiyel. Bu DNaz I nickleme ve DNA polimeraz ben çeviri arasındaki doğru dengeyi elde etmek için önemlidir; çok fazla DNaz Ben, çok az çeviri başlatmak için polimeraz için yeterli rumuz üretmek değil, düşük verim ve kısa parça boyutları veren aşırı DNA sindirim neden olacaktır büyük parça boyutu ve aminoallyl-dUTP kötü dahil verir. Aşağıdaki protokol, iyi çalışır ancak farklı gruplar veya farklı üreticilerin DNAz I titre etmek için gerekli olabilir. 16 2 saat boyunca buz ve inkübe reaksiyon etiketleme ° C kurun Bu 0.5-1 mg nick-tercüme DNA üretmek gerektiğini ve kadar ölçeklendirilebilir. DNase I tamponu DNase I 01:30 (örneğin 0.3 U / ml) seyreltilir. 1 "> Bileşen Stok konsantrasyonu Hacim veya miktar BAC DNA 5-10 mg NTB tampon 10x 5 ul DTT 0.1 M 5 ul dNTP karışımı 10x 5 ul Aminoallyl-dUTP 0.5 mM 6 ul , DNA polimeraz 10 U / ml 1 ul DNase I, 10 U / ml 1 ul (a 1:30 seyreltme) H2O 50 ul Etiketli parçaları büyüklüğü kontrol etmek için bir 2% agaroz jel üzerinde 1 ul çalıştırın. Eğer jel çalıştırırken, buz üzerinde reaksiyon tutun. Başarılı nick translation ~ 1 kb (: Temsilcisi Sonuçlar bakınız KRİTİK ADIM) bazı büyük parçaları ile 150 bp ve 700 bp arasında çalışan parçaları büyük bir kısmı ile bir karalama neden olur. Gerekirse, 15-30 dakika boyunca 16 taze bir DNase I 1:30 seyreltme ve inkübe da 1 ul ° C'de ilave edin. İnkübasyon süresi BAC DNA miktarı ve kalitesine göre değişir. 10 dakika boyunca 75 ° C, ısıtılarak DNase I inaktive eder. PCR saflaştırma kiti kullanılarak temizleme amin ile modifiye edilmiş DNA. 100 ul H 2 O içinde Zehir 10 ul 3 M NaOAc (pH 5.2) ve 275 ul etanol ekleyerek Etanol çökelti DNA. En az 1 saat ya da gece boyunca -20 ° C'de tutun. 4, 30 dakika süreyle maksimum hızda dönmeye ° C 500 ul% 70 etanol ile pelet yıkayın ve kurumaya bırakın. Bu adım, etiketleme reaksiyon engel olacak iz aminler kaldırır. 1x ilk tepki başına 6 ul H 2 O tekrar süspansiyon pelet. Amin ile modifiye edilmiş DNA konsantrasyonu belirlemek için 1 ul kullanınmicrovolume UV spektroskopisi ile. 1.2. Floresan Boya Kaplin Probun fluoresan etiketleme boyanın kimyasal bağlanması ile elde edilir. Alexa Fluor süksinimidil ester, boyalar, böylece doğrudan işaretli problar, üretim, kovalent bir bağ oluşturmak üzere bir amino-modifiye allyldUTP DNA aminler ile reaksiyona girerler. Alexa Fluor 488, 555, ve 647 boyalar bu işlem için başarılı olmuştur. 5 ul bir hacme kadar amino-alil değiştirilmiş DNA'nın 4 ug ayarlama, sıcaklık 95 ° C de 5 dakika boyunca buz üzerinde, serin ek ve 0.2 M NaHCO3 3 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 2 ml susuz DMSO içerisinde amin reaktif boyanın bir alikotu çözdürülür. NaHCO3, girdap, 1 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında darbe spin ve inkübe ile 8 ul değiştirilmiş DNA ekleyin. Not: amin reaktif boyalar aşağıdaki şemaya göre birden fazla sensör etiketlemek için kullanılabilir. O zamandan beriprob nly 10-20 ng slayt etiketleme başına kullanılır, 1 mg 50-100 slaytlar için yeterli prob verir. Bu, -20 ° C de gelecekte etiketleme reaksiyonlar için amin ile modifiye edilmiş DNA saklamak da mümkündür DNA miktarı DNA hacmi 0.2 M NaHCO3 Boya Cilt Toplam Yeter için 4 x 1 ug 1.25 ul her 0.75 ul her 0.5 ul her 2.5 ul (1/4) 50-100 slayt her 3 x 1.35 mikrogram 1.67 ul her 1 ul her bir 0.67 ul her 3.34 ul (1/3) 65-130 slayt her 2 x 2 mikrogram 2.5 ul her 1.5 ul her 1 ul her bir 5 ul (1/2) 100-200Her slaytlar 1 x 4 mg 5 ul 3 ul 2 ul 10 ul (tam) 200-400 slaytlar 90 ul H2O ve bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak arındırmak etiketli prob ekleyin. 100 ul 10 mMTris-Cl (pH 8.5) içinde Zehir. Beer-Lambert denklemler (Talimatlar Alexa Fluor reaktif boyalar eşlik eden ya da online olarak bulunabilir veri sayfasında verilmiştir) kullanarak microvolume tam spektrum spektroskopisi (bkz. Şekil 2) ile prob konsantrasyonu ve etiketleme verimliliği belirleyin. 100 bp başına 3-6 boyalar içeren problar iyi çalışır. Kuruluş daha düşük derecelerde sondalar zayıf BALIK sinyalleri verebilir. Alternatif olarak, DNA olmadan% 2'lik agaroz jel üzerinde 5 ul çalıştırmak leke ve bir phosphoimager kullanarak floresan boya ile birleşmesiyle kontrol edin. Bromür veya DNA boyama alternatifleri ile jel sonrası-leke ve toplam DNA işaretli DNA karşılaştırmak. <pclass = "jove_title"> 2. DNA BALIK Aşağıdaki adımları ile, ilgi hücreleri slaytlar için sabit ve permeabilize. Hücresel DNA ve doğrudan etiketli probları sonra sıcak bir plaka üzerinde birlikte doğallığından ve bir ışık geçirmez nemlendirilmiş bir odasında gece melezi. 2.1. 1. Gün Probe Yağış Not: 1. Gün boyunca bir noktada Çökelme prob. Bu, konforlu bir şekilde hücrelerin tedaviye paralel olarak yapılabilir ve günün başlangıcında yapılabilir zorunda değildir. 10-20 ng doğrudan etiketli prob, 6 ul C 0 t-1 DNA (6 mg), somon testis 1 ul tek zincirli DNA (9.7 mg) karıştırın ve su ile 100 ul ses seviyesini ayarlamak. Vorteks 10 ul 3 M NaOAc ve 275 ul EtOH, ve karışımı ekleyin. -20 ° C'de en az 1 saat boyunca çökeltilmesi 4, 30 dakika süreyle maksimum hızda mikrofüjde Spin ° C % 70 EtOH ile pelet yıkayın ve tekrar döndürebilirsiniz. Kuru peletve 5 ul deiyonize formamid içinde süspansiyon haline getirin. Işıktan korunmalıdır 1000 rpm'de (termomikser üzerinde yer folyo) sallayarak ise 37 ° C de 30 dakika tekrar. 37 dekstran sülfat karışımı 5 ul ekleyin ve 10 dakika daha sallamak ° C daha ışıktan korunmalıdır. Sadece lamel üzerine pipetleme önce ve aşağı yukarı pipet. Not: BAC probları, uygun bir seçenektir hazır kullanımlı hibridizasyon karışımı sağlanır tüm kromozom boyama probu ile birlikte kromozom boyama için. Süspanse BAC prob çöktürülmüş (C 0 ile somon testislerden t1 DNA ve tek sarmallı DNA) yukarı pipetleme ve aşağı ile 10 ul kromozom boya karışımı. 10 dakika boyunca 300-500 rpm'de çalkalama sırasında 37 ° C'de inkübe edin. Kromozom boya / nokta başına BAC prob karışımı 10 ul kullanın. Slaytlara Hücreler takılması Not: slaytlar uymak için hücreler eğilimi büyük ölçüde hücre tipine göre değişir. Her hücre tipi için, tespiten iyi ampirik zaman ve hücre yoğunluğu yerleşme. Tutarlı sonuçlar için, hücreler tek bir hücre süspansiyonu içinde olmalıdır. PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi hücreleri için bu mutlaka gerekli değildir, ancak kullanım kolaylığı için daire hücreleri bölge, bir hidrofobik kalemi ile tespit edilecektir. Bir hidrofobik bariyer, slayt üzerinde yayılmasını süspansiyon engeller slayt güzel ayrılmış başına üç numune kadar tutar ve immün-FISH antikor çözüm çok küçük hacimli kullanımı için izin verir. Hücre sayıları düşük Ayrıca, tespit alanı minimumda tutulabilir. Fare fetal karaciğer hücreleri Ve aşağı yukarı pipetleme PBS ve tekrar süspansiyon yaklaşık 1.5 ml her E13.5 fare fetal karaciğer toplayın. 2 dakika 3.000 rpm'de mikrofuge'ye Spin. Tekrar üç kez yıkar. 70 um'lik bir elekten geçen yıkama, şekil hücre. 160 ul PBS içinde bir karaciğer hücreleri tekrar süspansiyon ve nokta başına 50 μ kullanın. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca yerleşmek için hücreler bırakın. Mouse ES Hücreler 1. Fare ES hücrelerinin slayt kolayca yapışmaz. Bir slayt, daire alan hücrelerin bir hidrofobik kalemi ile tespit edilecektir. Daire içine, normal kültür ortamı, pipet 80-100 ul başına 20,000-50,000 hücre süspansiyonu hazırlamak ve nemlendirilmiş bir inkübatör Not yaklaşık 3 saat boyunca monte ediniz:. Alternatif olarak, ES hücreleri slaytlar üzerinde kültüre edilebilir, ancak daha sonra oluşturacak otomatik görüntüleme engel olabilir koloniler. Sabit Hücreler 1. Bazı deneyler kendileri tarafından slaytlar eklemek olmayan sabit hücrelerin kullanılmasını gerektirir. Bir Sitosantrifüj ile 3 dakika 300 rpm'de Nazik iplik hücrelerin üç boyutlu yapısını korur ve hücrelerin düşmek yok olmasını sağlar. Hücre tipi Süspansiyon Zaman yerleşme Yorum FareFetal karaciğer PBS 2 dakika Bankta Fare ES Takviyeleri ile DMEM 4 saat Nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 37 ° C Fare lenfositler PBS 2 dakika Bankta Fare P20 germ hücreleri Çözelti içinde saptamak Sitospin Bankta 10 dakika: hücreler,% 4 PFA yavaşça daldırın slayt (davlumbaz gerçekleştirmek DİKKAT) düzeltmek için. . Hücrelerin iyi tutma (bir ipucu kutusunun kapağı örneğin 50 ml% 4 PFA) için bir tepside düz slayt Not hücreleri Fix: Bu adım slaytlara eki önce sabit hücreler için geçerli değildir. Tüm sonraki basamaklar, 50 ml veya 100 ml Coplin kavanoz kullanın. Kavanoz arasında slayt taşırken hücreleri kazımak için dikkat edin. 0.1 M Tris-C QuenchL, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca pH 7.4 '. % 0,1 'lik hücre geçirgenliği saponin/0.1% Triton, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde X-100. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde iki kez yıkayın. .% 20 gliserol / oda sıcaklığında PBS Note en az 20 dakika süreyle inkübe edilir: Bu noktada, slaytlar, en az birkaç hafta içinde -20 ° C'de% 50 gliserol / PBS içinde saklanabilir. Bu sinyal kuvveti 9 artışa günde en az bir sonuç için, depolama gözlenmiştir. . Not devam etmeden önce oda sıcaklığında 20% gliserol / PBS içinde yeniden kalibre: Bu sondalar (2.1.1) tetikleyici başlatmak için uygun bir noktadır. 3x dondurma / sıvı azot içinde çözülme. Küçük bir Dewar kullanılarak sıvı azot içinde bir seferde bir slayt daldırın. Birkaç saniye ve karakteristik bir patlama sesi sonra geri ve defrost için kağıt havlu üzerine yer. Tekrar dondurmak sonra kaybolur opak dondurulmuş gliserol bekleyin. En fazla 15 slayt üç donma / çözülme döngüsü için rotasyon rahatça yapılabilir. WOda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez PBS içinde kül. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 0.1 M HCl içinde inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde yıkanır. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.5% Triton saponin/0.5 X-100/PBS olarak geçirgenliği. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde iki kez yıkayın. , Oda sıcaklığında en az 10 dakika boyunca% 50 formamide/2x SSC dengelenmesi. Bir lamel üzerine pipet prob. Kavanoz slayt çıkarın ve bir kağıt havlu ile hücre nokta (lar) etrafında herhangi bir aşırı sıvı kapalı kuru. Formamid çabuk kurur gibi, hücrelerin kurumasına dikkat edin. Iki ya da üç hücre noktalar ile slaytlar için, slaytta yer nokta x 50 mm lamel gelen bir 22 mm üzerine nokta başına prob 10 ul geçerlidir. Nokta (lar) üzerinde slayt üzerine lamel ters. Kauçuk çimento ile Seal ve bu tamamen kurumasını bekleyin. Sonraki tüm aşamalarında ışıktan koruyun. 78 Isı slaytlar ° C sıcak bir plaka üzerinde tam 2 dakika (ters ısıtma bloğu, KRİTİK ADIM örneğin: Tartışma bakınız). Bir kapak (karton kutu ya da sim yerleştirin sıcak plaka üzerinde ilar) denatürasyon sırasında ışıktan korumak için. Bir ışık geçirmez nemlendirilmiş odası içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin. , Nemlendirmek bir ışık geçirmez kutu kağıt havlu koyun ve su ile nemlendirin için. 2.2 2. Gün Sonraki yıkama adımlar için doğru sıcaklıkta çözümlerle Coplin kavanoz hazırlayın. Sonraki tüm adımları sırasında mümkün olduğunca ışıktan slaytlar koruyun. Bir kahve Coplin kavanoz için iyi bir ışık geçirmez kapak yapar olabilir. Kauçuk çimento ve 2x SSC yer slayt kalkmasına lamelleri gevşetin ve kapalı slayt kadar. 45 ° C'de 15 dakika boyunca en az% 50 formamide/2x SSC ile yıkayın Su banyosunda yerleştirin kapak ışıktan korumak için. 63 ° C'de 15 dakika 0.2x SSC ile yıkama ° C 45 ° C'de 5 dakika boyunca 2 x SSC ile yıkanır Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2 x SSC ile yıkanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde yıkanır. RT'de Coplin kavanoz içinde 2 dakika için DAPI (5 ug / 2x SSC mi) ile Leke. içerik "> Not: DAPI çözüm 4 saklanabilir ° 2 ay boyunca karanlıkta C. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde destain. Lamel monte etmek için, pipet bir lamel üzerine montaj orta. Bir nokta, ve 22 mm Çift üç sıra için x 50 mm lamelleri için 22 mm x 22 mm lamelleri kullanarak, hücre nokta başına 10 ul kullanın. Hücre nokta mümkün olduğu kadar etrafında PBS kapalı kuru ama hücrelerin kurumasına dikkat çekmek. Slayt üzerine lamel ve tırnak cilası ile mühür ters.