単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション

1。準備とクリーニングをスライドさせて マイクロ流体チャンバは、石英スライドとカバーガラスで構成されている。プリズム型全反射蛍光（TIRF）顕微鏡法では、石英スライドの表面が撮像される。したがって、十分にH 2 O、アセトン、KOH、およびピラニア溶液を使用して石英スライドをきれいにすることが重要である。 Thが、多段階の洗浄は、単一分子蛍光測定を妨害表面に蛍光性有機分子を排除している。さらに、ピラニアエッチングは、ヒドロキシル基を生成することにより石英表面を親水性にする。遊離ヒドロキシル基は、工程3におけるアミノ-シラン化反応のために必須である。 掘削石英スライド。 3月4日ミリのダイヤモンドドリルビット（ 図2a）と石英スライドへの正孔の対を開けます。複数のチャネルが必要な場合は、より多くのパドリルIRSの孔（ 図2b）。これらの穴は、ステップ7でマイクロ流体チャンバー内に溶液を注入するために使用される。 掘削中のH 2 O中の湿ったドリルビットを保持します。ドリルビットの寿命を増加させる潤滑剤としてH 2 Oを行う。 時折ドリルビットの先端をふくと、掘削穴に役立ちます。 穴あけした後、PEG化プロセスの間に容易に識別するためのスライドの片側をマーク。マーカーは後で混乱を避けるために基準として使用することができる。マーキングについては、ダイヤモンドドリルビットを使用することができる。インクが表面に得るかもしれないので、任意のペンを使用しないでください。 H 2 Oで洗浄するガラス染色ジャーにスライドを置きます。典型的には5〜15のスライドは、単一のジャーの中に配置することができる。ミリQ、H 2 Oでスライドをすすぐそれを3回繰り返し、汚れを除去するために5分間のMilliQ H 2 Oでスライドを超音波処理。水を配置して、再度3回スライドをすすぐミリQ H 2 Oは、130 Wは、このプロトコルで使用超音波処理能力であることに注意してください。高い超音波処理パワーは、石英スライドの寿命を低下させる可能性があります。 アセトンで清掃。アセトンでのMilliQ H 2 Oを交換してください。 20分以上スライドをアセトンで超音波処理する。 H 2 Oですすいだアセトンを破棄し、ミリQ、H 2 Oでスライドをすすぐ任意の残留アセトンを除去するために3回それを繰り返す。 KOHでクリーニング。 1MのKOHで水を交換して、20分以上のスライドを超音波処理。過度のエッチング（ 例えば一晩KOH処理）は、表面の質を向上しますが、蛍光イメージングを妨害する可能性があり、傷を、ご紹介します。 H 2 OですすいだKOHの痕跡を除去するために3回のMilliQ H 2 Oでスライドを洗浄します。 ピラニアエッチング。 デュランのスライドホルダーやカスタムメイドのテフロンホルダーとPLにスライドを転送する化学フードに位置して、ビーカー（1L）でそれらをエース。 H 2 SO 4の450ミリリットルビーカーを埋める。 H 2 SO 4との間の3:1の比及びH 2 O 2に対するH 2 O 2を150mlを加える。ソリューションは自然に沸騰し始めると、温度が90℃とともに増加必ずH 2 O 2溶液は、反応を開始する前に室温であることを確認してください。そうでなければ、沸騰溶液の温度を90℃より低くてもよい適切な混合のためのソリューションを撹拌し、ビーカーを20分間乱さしてみましょう。 スライドホルダーと一緒にピラニア溶液からスライドを取り、ミリQ H 2 Oを含むスライドホルダーに入れてそれが室温に達する一方、指定された廃液ボトルにピラニア溶液を捨てる。 ミリQ、H 2 Oでスライドを3回すすぎ細心の注意は、さらにステレオに注意が必要ですスライドの任意の可能な汚染を避けるためにピコ。 3に進みます。これは、すぐに次の手順を続行することをお勧めします。 *注意：ピラニア溶液は非常に反応性である。このソリューションの取り扱いには特別な注意を払うべきである。また、時にアセトン等の有機溶剤と混合して誤って、それが爆発の原因となります。 2。カバースリップのクリーニング マイクロ流体室は石英スライドとカバーのリップで構成されている。プリズム型TIRF顕微鏡を用いる場合には、カバースリップの表面が画像化されていない。したがって、唯一のH 2 O及びKOHでカバーガラスを清掃するのに十分である。ケースでカバーガラス（例えば客観型全反射顕微鏡を介して）画像化される必要がある、それはピラニア溶液（ステップ1.7）でカバースリップを治療することをお勧めします。カバースリップ表面のPEG化は、高品質ではない場合、それはタンパク質のためのシンクとして作用し得ることに留意されたいタンパク質濃度の変動を生じさせるdは。 H 2 Oですすいだ場所カバースリップガラス染色ジャー（24×30、24×40、または24×50ミリメートル2）。典型的には5〜15カバースリップは、単一のジャーに入れることができる。ミリQ、H 2 Oでカバーグラスを3回すすぎ KOHでクリーニング。 1M KOHで水を交換して、20分以上カバースリップを超音波処理。 H 2 OですすいだKOHの痕跡を除去するためのMilliQ H 2 Oでカバーグラスを3回すすいでください。 3に進みます。 スライドとカバーガラスの3。アミノ – シラン化 アミノ-シラン化化学を介してアミン基と石英スライドとカバースリップの表面を官能化する。メタノールはアミノ-シラン化反応の触媒としての溶媒と酢酸として使用される。 メタノールですすいだ。 Sから（染色皿にミリQ H 2 Oを交換してくださいメタノールでTEPS 1および2）。ステップ3.3までメタノールのスライドとカバースリップを保つ。メタノール中の不純物が表面に吸着するので、（ 例えば数時間）の時間を不必要に長期間スライドとメタノール中でカバースリップを保管しないでください。 アミノシラン化溶液を調製する。 メタノールでパイレックスフラスコを数回すすいでください。 5分以上のメタノールで、フラスコを超音波処理。それは清浄に保たれている専用のフラスコを持っていることをお勧めします。 フラスコにメタノール100mlを注ぐ。 酢酸5mlを追加します。 APTESの3ミリリットル（3 – アミノプロピルトリメトキシシラン）を追加し、軽く振って混和する。 アミノ – シラン化。 aminosilanizationの反応混合物とスライドとカバースリップが含まれている染色皿にメタノールを交換してください。 20から30分間インキュベートします。インキュベーション中、1分間超音波処理一度。 メタノールですすいだ。 Aを交換してくださいメタノールとminosilanization反応。メタノールを捨て、新鮮なメタノール溶液を加える。この手順を3回繰り返します。 ポリマー（1回戦）を使用する4。表面パッシベーション NHS-エステル、ポリエチレングリコール（PEG）を結合することによって石英スライドとカバースリップのアミン被覆表面を不動態化する。この反応物を一晩、pH8.5のPEG溶液の飽和濃度を用いて行われる。 スライドとカバースリップを乾燥させる。スライドとN 2ガ ​​スを使用してカバーグラスを乾燥させ、PEG化である必要があります側が上を向いているような方法で、きれいなピペットのボックスに配置します。ピペットボックスは部分的にミリQ H 2 Oで満たされているこの湿った環境では、一晩のインキュベーションの間に乾燥からPEG化ソリューションを防ぐことができます。 反応バッファーを調製した。 10ml中の炭酸水素ナトリウム84mgを溶解することによって、新鮮な炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH8.5）中の0.1 Mを調製ミリQ H 2 O pHを調整する必要がない。この溶液を次の利用（ 例えば、工程6.1）のために凍結保存することができる。 PEG化溶液を調製する。 1.5mlチューブ中のNHS-エステルのmPEG（5000 Da）でのNHS-エステルPEG（5000 Da）で13と8 mgのビオチン化0.2mgのPEGの混合物を準備します。スライドの数Nを調製する場合、単一のチューブ内でPEG混合物のN倍大きい量を準備する。 新たに調製されたバッファ（ステップ4.2）の64μL（またはN回スライドのN個の数の64μL）を追加します。完全に溶解させるために上下にピペット。 気泡を除去するために1分間、16,100×gで遠心分離して。その後ピペットないでください。そうでなければ、気泡は、ステップ4.4でPEG化干渉する形成する。 PEG化。 ステップ4.1からの乾燥石英スライドにPEG化混合物の70μlをドロップします。 24×50ミリメートル2 COV例に90μlを使用するerslip。 ゆっくりと溶液上にステップ4.1からの乾燥カバースリップを配置。 、PEG化の均一で高い品質を持つように、気泡を導入しないように注意してください。表面張力により、気泡の大部分は自然に表面張力により5分以内に反応容積を残すことができる。 暗くて湿気の多い環境でのスライドをインキュベートします。我々はpH8で使用するNHS-エステルPEGの半減期は約1時間である。最低でも、2時間のためにそれらをインキュベートする。一晩のインキュベーションは、PEG化（データは示さず）のより高い品質をもたらす。 5。長期保存 -20ºCでPEG化スライドや、N 2中のカバースリップを保存する スライドとカバースリップを乾燥させる。慎重に、側にカバースリップをスライドさせて、スライドとカバーガラスを分解をMilliQ H 2 Oでそれらをすすぎ、およびN 2とそれらを乾燥させます。 スライドとカバースリップを保存する。フォーRすぐに使用、ペグ（ステップ6）の第二ラウンドのための手順に従ってください。長時間保管するために、次の手順に従います。 一対のスライド及びPEG化された面が互いに離れる対向するよう50mlチューブ中でカバースリップを置く。 部分的に、チューブを閉じ、チューブを真空した後、N 2でそれを埋める。これらのステップは、長時間のPEG化された表面を維持するのに役立ちます。しっかりとチューブをねじ込み、-20℃で保管しスライドの品質は、最大3ヶ月（ 図3a、右 ）こだわりのまま。 ポリマー（2回戦）の使用6。表面パッシベーション PEG層の密度の高いをすると、表面上の任意の残りのアミン基をクエンチするPEG化の追加のラウンド。ショートNHS-エステルPEG分子（333ダルトン）の使用は、既存のPEG層に浸透するのに有効であり得る。これはRECです右側のスライドを使用する前に、PEG化のこの第二ラウンドを行う奨。 反応バッファーを調製した。新鮮な炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 8.5）の0.1 Mを準備します。ステップ4.2からの凍結溶液を使用することもできる。 PEG化溶液を調製する。炭酸水素ナトリウム緩衝液の63μlの250 mMのT4-PEGの7μLを溶解する。 PEG化。ステップ4.4と同様の手順に従ってください。晩まで30分間インキュベートします。 スライドとカバースリップを乾燥させる。一対のスライドとカバーガラスを分解し、ミリQ H 2 Oで、それらを洗い流し、N 2でそれらを乾燥し、きれいなピペットボックスに保管してください。ステップ7で、マイクロ流体チャンバーの組み立てに進みます。 7。マイクロ流体チャンバーの組み立て PEG化された石英スライドとカバースリップのペアを使用してマイクロ流体チャンバを組み立てる。両面粘着テープがスペーサーとして使用される。室はそのように、エポキシ接着剤で密封しているlutionsは石英スライドの穴を通って導入されています。 PEG化面を上にして平らな面に石英スライドを置きます。 スライド上で、両面粘着性のテープを入れて斜めにPEG化表面上のチャネル（7ミリメートル、幅5）を作る。ホールはチャンネルの中心に位置していることを確認してください。チャンバーを製造するプロセスの間、PEG化表面を損なわないように注意してください。これは、（ 図2参照）を配置し、異なって両面粘着性テープを貼り付けることによって、マルチチャネルスライドすることが可能となる。 優しく室を完成させる上でPEG化カバースリップを配置。 PEG化側が下に向けなければならない。 両面テープが配置される領域の上にカバースリップを押すことによって、チャンバをシールする。チャンバーは水密閉なるように慎重に徹底的にそれを行う。 エポキシ接着剤をチャンバーの端を閉じます。 上ストレプトアビジンまたはニュートラを固定化P200ピペットを用いて、T50において、ストレプトアビジン又はニュートラアビジン溶液（10mMトリス-HCl [pH8.0中]、50 mMのNaCl緩衝液）の0.1 mg / mlの50μlの添加することによりビオチン化PEG層。 T50緩衝液100μlと同一平面のインキュベーションの1分後。 あなたの1分子イメージングのためのビオチン化の生物学的分子を追加します。 8。リサイクルをスライドさせます 石英スライドをリサイクルする。使用済みのスライドをカバーグラスや、両面粘着性のテープを外すことによってリサイクルされています。 使用後は、水道水に室に保管してください。水中での長期的なインキュベーションチャンバーの分解が容易になります。 マイクロ波を用いた水道水室を沸かす。パイレックスビーカーを使用してください。 10分以上煮る。 カミソリの刃を使用してカバースリップし、両面粘着性のテープを脱ぐ。その平面に垂直な石英スライドを押さないでください。それ以外の場合は、分割します。離れてチャネルからかみそりの刃を保つ。 OTherwise、チャネル上の傷が導入されています。 指で擦って家庭用洗剤を使用してスライドを洗浄します。 ガラス染色ジャーにスライドを置きます。典型的には5〜15のスライドは、単一のジャーの中に配置することができる。 10％の家庭用洗剤を追加し、20分以上のスライドを超音波処理。タブ多量の水でスライドを洗浄します。 1.2に進みます。