פסיבציה משטח ללימודי חלבון מולקולה בודדת

1. החלק הכנה וניקוי תא microfluidic מורכב משקופית קוורץ וcoverslip. בקרינת השתקפות הפנימית מוחלטת פריזמה הסוג מיקרוסקופית (TIRF), את פני השטח של שקופית קוורץ הוא הדמיה. לכן, חשוב לנקות את שקופיות ביסודיות באמצעות קוורץ H 2 O, אצטון, KOH, ופתרונות פיראניה. ה היא ניקוי רב שלבים מבטל מולקולות אורגניות ניאון על משטח אשר מפריע למדידות הקרינה מולקולה בודדות. בנוסף, תחריט פיראניה עושה הידרופילי משטח קוורץ על ידי יצירת קבוצות הידרוקסיל. הקבוצות הידרוקסיל חופשיות הן חיוניות לתגובת האמין silanization בשלב 3. שקופיות קוורץ הקידוח. מקדחה זוג החורים לתוך שקופית קוורץ עם קצת 3/4 מקדח יהלום מ"מ (איור 2 א). אם מספר רב של ערוצים הם רצויים, לקדוח יותר הרשותמס ההכנסה של חורים (איור 2b). חורים אלה משמשים להזרקת פתרונות לתוך תא microfluidic בשלב 7. שמור על המקדח רטוב בH 2 O במהלך הקידוח. H 2 O מבצע כחומר סיכה, המגדיל את אורך החיים של המקדח. מדי פעם לנגב את קצה המקדח עוזר קידוח חורים. לאחר קידוח חורים, לסמן צד אחד של השקופיות לזיהוי קל במהלך תהליך PEGylation. הסמנים יכולים לשמש כנקודת התייחסות כדי למנוע בלבול בשלב מאוחר יותר. לסימון, ניתן להשתמש במקדח יהלום. אין להשתמש בכל עט מאז הדיו עלול לעלות על פני השטח. ניקוי עם H 2 O. מניחים את השקופיות בצנצנת מכתים זכוכית. יכולות להיות ממוקמות בדרך כלל 5-15 שקופיות בצנצנת אחת. יש לשטוף את השקופיות עם MilliQ H 2 O. חזור על זה 3 פעמים וsonicate השקופיות עם MilliQ H 2 O למשך 5 דקות כדי להסיר לכלוך. השלך את המים ולשטוף את השקופיות שוב 3 פעמים עםH 2 O. הערה MilliQ ש130 W הוא כוח sonication משמש לפרוטוקול זה. כוח sonication גבוה עשוי להקטין את משך החיים של שקופיות קוורץ. ניקוי עם אצטון. החלף את MilliQ H 2 O עם אצטון. Sonicate השקופיות עם אצטון עבור 20 דקות או יותר. שטיפה עם H 2 O. מחק את אצטון ולשטוף את השקופיות עם MilliQ H 2 O. חזור על זה במשך 3 פעמים כדי להסיר שאריות אצטון. ניקוי עם KOH. החלף את המים עם 1 M KOH וsonicate השקופיות עבור 20 דקות או יותר. תחריט מוגזם (למשל טיפול KOH לילה) ישפר את האיכות של פני השטח, אבל יציג סריטות, שעלול להפריע לדימות פלואורסצנטי. שטיפה עם H 2 O. יש לשטוף את השקופיות עם MilliQ H 2 O ל3 פעמים כדי להסיר עקבות של KOH. תחריט פיראנה. העברת השקופיות להחזיק שקופיות דוראן או בעל טפלון מחוייט וplאס בכוס (1 ליטר) שממוקמת במנדף כימי. למלא את הכוס עם 450 מיליליטר של H 2 SO 4. הוסף 150 מיליליטר של H 2 O 2 ל3:01 יחס בין H 2 SO 4 ו-H 2 O 2. ברגע שהפתרון מתחיל לרתוח באופן ספונטני, הטמפרטורה מגבירה מעל 90 ° C. ודא כי פתרון H 2 O 2 הוא בטמפרטורת חדר לפני שמתחיל את התגובה. אחרת, את הטמפרטורה של הפתרון הרותח עשויה להיות נמוך מ90 ° C. מערבבים את הפתרון לערבוב נכון ולתת את הכוס באין מפריעה ל20 דקות. קח את השקופיות מפתרון Piranha יחד עם מחזיק השקופיות, ולשים אותם בהחזיק שקופיות המכיל MilliQ H 2 O. בינתיים, לבטל את פתרון Piranha לתוך בקבוק פסולת מיועד ברגע שהוא מגיע לטמפרטורת חדר. יש לשטוף את השקופיות 3 פעמים עם MilliQ H 2 O. טיפול נוסף צריך להילקח בSTE נוסףנ.ב. כדי למנוע כל זיהום אפשרי של שקופיות. המשך לשלב 3. זה מומלץ להמשיך מייד בשלבים הבאים. * זהירות: פתרון Piranha הוא מאוד תגובתי. בעת הטיפול בפתרון זה יש לנקוט במשנה זהירה. בנוסף, כאשר בטעות מעורבבת עם ממסים אורגניים כגון אצטון, זה עלול לגרום לפיצוץ. 2. ניקוי Coverslip תא microfluidic מורכב משקופית קוורץ ושפות של כיסוי. כאשר מיקרוסקופ TIRF פריזמה סוג משמש, את פני השטח של coverslip לא צילם. לכן, זה מספיק כדי לנקות coverslip רק עם H 2 O ו KOH. במקרה coverslip צריך להיות צילם (למשל באמצעות מיקרוסקופיה TIRF האובייקטיבי מהסוג), מומלץ לטיפול בcoverslips עם פתרון Piranha (שלב 1.7). שימו לב שאם PEGylation של פני השטח coverslip הוא לא באיכות גבוהה, זה יכול לפעול ככיור לחלבוניםd להצמיח וריאציות בריכוז החלבון. שטיפה עם H 2 O. coverslips מקום (24 x 30, 24 x 40, או 24 x 50 2 מ"מ) בצנצנת מכתים זכוכית. יכול להיות ממוקם בדרך כלל 5-15 coverslips בצנצנת אחת. שטוף את coverslips 3 פעמים עם H 2 O. MilliQ ניקוי עם KOH. החלף את המים עם 1M KOH וsonicate coverslips עבור 20 דקות או יותר. שטיפה עם H 2 O. שטוף את coverslips 3 פעמים עם MilliQ H 2 O כדי להסיר עקבות של KOH. המשך לשלב 3. 3. אמינו-silanization של שקופיות וCoverslips Functionalizing את פני השטח של שקופיות קוורץ וcoverslips עם קבוצה אמין באמצעות הכימיה האמין silanization. מתנול משמש כממס וחומצה אצטית כזרז לתגובת האמין silanization. שטיפה עם מתנול. החלף את 2 O MilliQ H במנות מכתים (מSteps 1 ו -2) עם מתנול. שמור את השקופיות וcoverslips במתנול עד שלב 3.3. אין לאחסן את השקופיות וcoverslips במתנול לתקופה ארוכה שלא לצורך זמן (כמה שעות לדוגמא) מאז זיהומים במתנול יהיה לספוג אל פני השטח. הכנת פתרון האמין silanization. יש לשטוף את בקבוק פיירקס מספר פעמים עם מתנול. Sonicate הבקבוק עם מתנול במשך 5 דקות או יותר. מומלץ לי בקבוק ייעודי שנשמר נקי. יוצקים של מתנול 100 מיליליטר לתוך הבקבוק. הוסף 5 מיליליטר של חומצה אצטית. הוסף 3 מיליליטר של APTES (trimethoxysilane 3-aminopropyl) ולערבב בעדינות על ידי טלטולו. אמינו-silanization. החלף את מתנול במנות הצביעה המכילות את השקופיות וcoverslips עם תערובת תגובת aminosilanization. דגירה של 20-30 דקות. במהלך דגירה, sonicate פעם דקות 1. שטיפה עם מתנול. החלף אתתגובת minosilanization עם מתנול. מחק את מתנול ולהוסיף פתרון מתנול טרי. חזור על תהליך זה שלוש פעמים. 4. פסיבציה פני השטח באמצעות פולימרים (סיבוב הראשון) Passivating המשטח מצופה האמין של שקופיות קוורץ וcoverslips ידי conjugating פוליאתילן גליקול NHS-אסטר (PEG). תגובה זו מתבצעת עם הריכוז להרוות של פתרון PEG ב-pH 8.5 הלילה. ייבוש שקופיות וcoverslips. ייבש את השקופיות וcoverslips באמצעות גז N 2 ולמקם אותם בקופסות פיפטה נקיות באופן כזה שהצד שבו יש להיות PEGylated הוא פונה כלפי מעלה. תיבת פיפטה מתמלאת באופן חלקי עם MilliQ H 2 O. סביבה לחה זה מונעת פתרון PEGylation מהתייבשות במהלך הדגירה הלילה. הכנת מאגר תגובה. הכן 0.1 M של חיץ סודיום ביקרבונט הטרי (pH 8.5) על ידי המסת 84 מ"ג של סודה לשתייה ב10 מיליליטר שלMilliQ H 2 O. אין צורך בהתאמת ה-pH. פתרון זה עשוי להיות מאוחסן קפוא לשימוש הבא (לדוגמא שלב 6.1). הכנת פתרון PEGylation. הכן תערובת PEG של 0.2 מ"ג biotinylated NHS-אסתר PEG (5,000 דא) 13 ו8 מ"ג של NHS-אסתר MPEG (5,000 דא) בצינור 1.5 מיליליטר. בעת הכנת מספר N של שקופיות, להכין כמות גדולה יותר פעמים N של תערובת PEG בצינור יחיד. הוספת 64 μl (או N פעמים 64 μl עבור מספר N של שקופיות) של החיץ מוכן הטרי (שלב 4.2). פיפטה אותו למעלה ולמטה על מנת לפזר אותם לחלוטין. צנטריפוגה עם 16,100 XG דקות 1 כדי להסיר בועות אוויר. אל פיפטה לאחר מכן. אחרת, בועות אוויר יהוו אשר מפריעות PEGylation בשלב 4.4. PEGylation. זרוק 70 μl של תערובת PEGylation לשקופית קוורץ יבשה משלב 4.1. השתמש 90 μl במקרה של 24 x 50 מ"מ 2 coverslip. מניח בעדינות coverslip מיובש משלב 4.1 על הפתרון. להיות אחידה ואיכותי של PEGylation, לדאוג שלא להכניס בועות אוויר. בשל מתח פנים, רוב בועות האוויר יכול באופן ספונטני לעזוב את נפח התגובה תוך חמש דקות בשל שטח מתח. דגירה השקופיות בסביבה חשוכה ולחה. זמן מחצית החיים של NHS-אסתר PEG שאנו משתמשים ב-pH 8 הוא כשעה. לכל הפחות, דגירה אותם במשך שעה 2. דגירה הלילה מובילה לאיכות גבוהה יותר של PEGylation (מידע לא מוצג). 5. אחסון לטווח ארוך אחסון שקופיות PEGylated וcoverslips בN 2 ב -20 º C. ייבוש שקופיות וcoverslips. לפרק בזהירות את השקף וcoverslip על ידי הזזה את coverslip לצד, יש לשטוף אותם עם MilliQ H 2 O, ולייבש אותם עם N 2. אחסון שקופיות וcoverslips. עבורr שימוש מיידי, בצע את ההליך לסיבוב של PEGylation (שלב 6) השני. על מנת לאחסן לתקופה ארוכה יותר של זמן, בצע את השלבים הבאים. הנח זוג השקופיות וcoverslip בצינור 50 מיליליטר כך שמשטחי PEGylated עומדים בפני אחד מהשני. חלקית לסגור את צינור ואקום הצינור, ולאחר מכן למלא אותו עם N 2. צעדים אלה יסייעו לשמר את משטח PEGylated לתקופה ארוכה של זמן. הברג את הצינור בחוזקה ולאחסן אותו ב -20 ° C. האיכות של השקופיות נותרת טובה לעד 3 חודשים (איור 3 א, מימין). 6. פסיבציה פני השטח באמצעות פולימרים (סיבוב השני) סבב נוסף של PEGylation לעשות צפוף שכבת PEG וגם כדי להרוות את כל קבוצות האמינים שנותרו על פני השטח. השימוש במולקולות קצרות NHS-אסתר PEG (333 דא) עשויות להיות יעילות בחודר לתוך שכבת PEG קיים. זה recommended לעשות סיבוב שני זה של PEGylation תקין לפני השימוש בשקופית. הכנת מאגר תגובה. הכן 0.1 M של חיץ סודיום ביקרבונט הטרי (pH 8.5). יכול לשמש גם הפתרון הקפוא משלב 4.2. הכנת פתרון PEGylation. ממיסים 7 μl של 250 מ"מ MS4-PEG ב63 μl של חיץ סודיום ביקרבונט. PEGylation. בצע את אותו התהליך כמו בשלב 4.4. דגירה במשך 30 דקות עד הלילה. ייבוש שקופיות וcoverslips. לפרק את הזוג של השקופית וcoverslip, יש לשטוף אותם עם MilliQ H 2 O, לייבש אותם עם N 2, ולשמור אותם בקופסא פיפטה נקייה. המשך להרכבת תא microfluidic בשלב 7. 7. הרכבה קאמרית Microfluidic הרכבת תא microfluidic באמצעות זוג שקופית קוורץ PEGylated וcoverslip. סרט דביק דו צדדי משמש כשומר רווח. החדר אטום עם דבק אפוקסי ו, כךlutions הם הציגו דרך החורים בשקופית קוורץ. מקום שקופית קוורץ על משטח שטוח עם צד PEGylated פונה כלפי מעלה. הפוך ערוץ (רוחב 5 עד 7 מ"מ) באלכסון על פני PEGylated ידי הצבת קלטות דו צדדיות דביקות על השקופית. ודא כי החורים ממוקמים במרכזו של הערוץ. יש להיזהר שלא לקלקל את משטח PEGylated במהלך התהליך של הפיכת תא. אפשר להפוך את שקופיות רב ערוצית על ידי הצבת ודבק הקלטות דו צדדיות דביקות באופן שונה (ראה איור 2). מניח בעדינות coverslip PEGylated על גבי כדי להשלים את החדר. צד PEGylated צריך להיות כלפי מטה. לאטום את החדר על ידי לחיצה על coverslip מעל האזור שבו קלטות דו צדדיות ממוקמות. לעשות את זה בעדינות אך ביסודיות, כך שהתא הופך למים בחוזקה אטום. סגור את הקצוות של החדר עם דבק אפוקסי. לשתק Streptavidin או Neutravidin עלbiotinylated PEG שכבה על ידי הוספת 50 μl של 0.1 מ"ג / מיליליטר של תמיסת Streptavidin או Neutravidin בT50 (, 50 חיץ mM NaCl [pH8.0] 10 מ"מ טריס-HCl) באמצעות פיפטה p200. לאחר 1 דקות של דגירה, לשטוף עם חיץ של T50 100 μl. הוספת מולקולות ביולוגיות biotinylated הדמיה המולקולה בודדת שלך. 8. Slide מחזור מחזור שקופיות קוורץ. שקופיות משומשות ממוחזרות על ידי לקיחה את coverslips והקלטות דו צדדיות דביקות. לאחר שימוש, לאחסן את התאים במים ברז. דגירה ארוך טווח במים מקלה על פירוק של התאים. מרתיחים את התאים במים ברז באמצעות מיקרוגל. השתמש בכוס פיירקס. מרתיחים במשך 10 דקות או יותר. תוריד את coverslips וקלטות דו צדדיות דביקות באמצעות סכין גילוח. אל תלחץ שקופית קוורץ בניצב למישור שלה. אחרת, הוא נשבר. שמור את סכין הגילוח מהערוץ. Otherwise, היא מציגה סריטות על הערוץ. יש לשטוף את השקופיות באמצעות חומרי ניקוי ביתי על ידי שפשוף אותם עם אצבעות. מניחים את השקופיות בצנצנת מכתים זכוכית. יכולות להיות ממוקמות בדרך כלל 5-15 שקופיות בצנצנת אחת. הוסף 10% חומר ניקוי ביתי וsonicate השקופיות עבור 20 דקות או יותר. יש לשטוף את השקופיות עם כמות גדולה של מים כרטיסייה. עבור לשלב 1.2.