Angiogenese er en kompleks udviklingsproces defineret ved dannelsen af ​​nye blodkar fra en allerede eksisterende fartøj netværket og er reguleret af flere signalveje. Den mest fremtrædende af disse er VEGF vej. VEGF er udgivet af iskæmiske celler og fører til indledningen af ​​angiogene spiring i tilstødende blodkar. Den førende endotelcelle fra en ny vaskulær spire er en "spids" celle, der producerer filopodia at nå ud mod kilden af ​​VEGF, og efterfølges af prolifererende 'stilk' endotelceller. På denne måde migrere aktiverede endotelceller og formere mod en avaskulær region, hvor de danner nye vaskulære rør. For at stabilisere disse rør til støtte blodgennemstrømning, endotelceller interagerer med pericytes og glatte muskelceller, som omgiver de nye blodkar ^1.. Angiogenese er afgørende for vaskularisering af embryonet og voksende væv. Men det bidrager også til mange pathological lidelser, såsom kræft, hvorimod defekter i angiogenese er forbundet med iskæmiske sygdomme. Udviklingen af ​​effektive lægemiddelbehandlinger at regulere angiogenese som et middel til behandling af sygdom er derfor af stor interesse. For eksempel vil en effektiv antiangiogene faktorer reducere kræft vækst, mens pro-angiogene strategier kan anvendes til behandling af iskæmisk sygdom. Således modeller for angiogenese er afgørende for bedre at forstå reguleringen af ​​nye fartøj dannelse og for at udvikle nye terapeutiske strategier for at forbedre eller mindske vaskulær vækst.

Et grundlæggende element i angiogenese forskning er valget af en passende vaskulær model. Mange in vitro-modeller er blevet designet til at gengive de grundlæggende trin af angiogenese, såsom endotelcellemigration, spredning og overlevelse ^2,3. En hyppigt anvendt in vitro assay er dannelsen af et forgrenet netværk af endotelceller på en Matrigel matrix, selvom thans er ikke specifikke for endotelceller, heller ikke inkorporerer sædvanligvis støtte pericytes eller glatte muskelceller. Vurdering af ex vivo spiring angiogenese ved hjælp af musen orgelkultur såsom embryoid organ assay den aortaringen assayet og fostrets metatarsal assay tillader analyse af angiogenese af endotelceller i forbindelse med yderligere understøttende celler. Men de største begrænsninger af disse assays indbefatter manglende blodgennemstrømning og regression af fartøjer over tid, hvilket giver et begrænset vindue til analyse. Derfor, for at forstå reguleringen af angiogenese mere præcist, er in vivo modeller kræves, såsom dem, der er udviklet i mus ved hjælp subkutant implanterede svampe eller Matrigel stik samt bagbenet iskæmi model. Men disse modeller udfordrende at analysere på grund af den komplekse 3D arkitektur neovessels. I modsætning hertil har zebrafisk embryo vist en fremragende model til visualisering angiogenese i heleorganisme ^4.. Men musen er evolutionært meget mere nært beslægtet med human end zebrafisk, gør musen en foretrukken model i mange tilfælde. Derfor angiogenese af postnatal muse nethinden repræsenterer et godt karakteriseret foretrukne metode til angiogenese forskning. Det er ikke alene et fysiologisk indstilling, men også en 2D vaskulær plexus, der let kan visualiseres ved hjælp af passende fluorescerende pletter. Arkitekturen af ​​fartøjet netværket, endotel proliferation, spiring, perivaskulær celle rekruttering og skib remodeling kan alle blive undersøgt ved hjælp af denne teknik.

I den neonatale mus nethinden, opstår udvikling af retinale blodkar i den første uge af postnatal liv. Mus, i modsætning til mennesker, er født, er blind og nethinder bliver kun vaskulariseret efter fødslen. Nethindekar opstår fra midten af ​​nethinden tæt på synsnerven på postnatal dag 0 (P0), og udvikles ved angiogenese at danne en meget organisered vaskulær plexus, der når nethinden periferien med ca P8 ^5.. Blodkar udvikle sig i en karakteristisk måde med kapillarrøret plexus gradvist voksende udad fra synsnervepapillen mod periferien til at generere en regelmæssig skiftende mønster af arterier og vener med en mellemliggende kapillær netværk. Den nethinden kar giver en ideel model for at studere angiogenese som skibene let kan identificeres som de vokser i, hvad det væsentlige er en 2D-plan, hvilket gør det relativt nemt at undersøge nethinden kar i flat-mount forberedelser ^5. En fremgangsmåde til isolering af muse neonatal nethinden til analyse af endotheliale tip celle responser over flere timer ex vivo er blevet rapporteret ^6.. Alternativt en mere detaljeret undersøgelse af hele nethinden kar og tilknyttede vaskulære markører kræver immunfarvning af faste nethinden prøver på forskellige stadier af udvikling.

Her giver vien detaljeret beskrivelse af en pålidelig og teknisk ligetil metode, som vi bruger til hele mount farvning af det murine nethinden vaskulære plexus, fra den indledende enucleation af postnatale øje (se også ⁷⁾ gennem farvningsresultaterne protokoller til den endelige billeddannelse under mikroskop.