Her beskriver vi en protokoll for optogenetic manipulering av motoneuronal aktivitet mens overvåke endringer i motoreffekt (muskel sammentrekning) i semi-intakt<em> Drosophila</em> Larver ved hjelp av lasere i en konvensjonell konfokalmikroskop. Denne teknikken gjør det mulig for forskerne å oppnå lokal forstyrrelse av nevral aktivitet i noen neuromeres å belyse dynamikken i motorkretser.
Drosophila larve bevegelse er en utmerket modell system i utviklingsmessige og fysiologiske Neuroscience, i kraft av den genetiske tilgjengelighet av de underliggende neuronale komponentene i kretsene 1-6. Bruk av optogenetics 7,8 i larve nevrale krets tillater oss å manipulere neuronal aktivitet i tid og rom av mønstrede måter 9-13. Vanligvis er prakteksemplarer bredt belyst med en kvikksølvlampe eller LED, er så spesifisitet av målet nevroner kontrollert av binære genuttrykk systemer som Gal4-UAS systemet 14,15. I dette arbeidet, for å forbedre romlig oppløsning for å "sub-genetiske oppløsning", vi lokalt opplyst en undergruppe av neuroner i ventrale nerve ledningen ved hjelp av lasere gjennomført på en konvensjonell konfokalmikroskop. Mens overvåke bevegelsen til kroppsveggen av den semi-intakt larver, vi interaktivt aktivert eller hemmet nevral aktivitet med channelrhodopsin 16,17 or 18-20 halorhodopsin, henholdsvis. Ved romlig og tidsmessig begrenset belysning av nervevev, kan vi manipulere aktiviteten av spesifikke nevroner i kretsen ved en bestemt fase av virkemåten. Denne metoden er nyttig for å studere sammenhengen mellom aktivitetene til en lokal nevrale forsamlingen i ventrale nerve ledningen og tid og rom mønster av motoreffekt.
Forward peristaltiske bevegelse i Drosophila larver skjer ved spredning av muskelkontraksjon fra bakre til fremre segment. Denne bevegelse oppnås ved sekvensiell aktivering av motoriske neuroner i løpet av den ventrale nerve ledning langs den langsgående aksen legeme. For å undersøke kretsene bak dette mønstret spre aktivitet, kunne lokal forstyrrelse av nevral aktivitet være en informativ tilnærming. Selv om farmakologisk assay kan styre spesifikk substans, så som nevrotransmittere, i nervevev, kan virkningen av farmakologiske stoffer være lik blant de nesten alle segmenter fordi larve ventrale nerve ledningen er repeterende struktur sammensatt av lignende neuromeres langs lengdeaksen. Alternativt kan man uttrykke optogenetic eller temperaturfølsomme probemolekyler i et lite antall segmenter. Imidlertid har slike spesifikke Gal4 linjene er svært vanskelig å generere. Her presenterer vi en metode for å manipulere nevroner i noen segmentmenter som bruker laser belysning. Benytte seg av den romlig begrenset belysning i konfokalmikroskopi, kan man forurolige aktiviteten til nerveceller i et lokalt område. Kombinert med uttrykket mønster av sonden av undergrupper av nervecellen-spesifikke Gal4 linjer, forbedrer denne laser belysning metoden sterkt romlig oppløsning for forstyrrelse. Og fordi denne metode krever bare en konvensjonell konfokalmikroskop, er kjøp av ytterligere laboratorieutstyr vanligvis ikke nødvendig.
Ved hjelp av denne teknikken, undersøkte vi betydningen av motor neuronal aktivitet i utbredelsen av motoreffekt 13. Ved å blokkere aktiviteten av motoriske neuroner i løpet av få boresegmenter peristaltisk bevegelse, var vi i stand til å teste hvorvidt aktiviteten av motoriske nevroner selv er nødvendig for forplantning av motoren utgangssignal. Lokale og forbigående blokade av motoriske nerveceller arrestert utbredelsen av peristaltiske bevegelser. Etter at blokkaden ble fjernet, propagation dukket opp på segment der bølgen hadde blitt arrestert. Dette fenomen antyder at uten motor neuronal aktivering, kan det propagative bølge ikke fremgang langs den ventrale nerve ledningen videre, og dermed aktiveringen av motor neuroner er nødvendig for peristaltiske bevegelse. Vi har tidligere rapportert detaljerte data og diskusjoner om dette fenomenet i Inada et al. (2011) 13. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å forurolige nevral aktivitet interaktivt samtidig å overvåke bevegelsen til det anatomiske larver. Ved hjelp av ulike Gal4 linjer og serier av Spatiotemporal mønstre for aktivitet manipulasjon, kan man undersøke krets logikk gjennom forstyrrelsene respons egenskapene til motoren krets.
Temporal og lokale endringen av nevral aktivitet er en uvurderlig teknikk for å analysere nettverket dynamikken i nevrale kretser. I denne protokollen, presenterer vi en metode for å manipulere nevral aktivitet ved optogenetics ved hjelp av en laser. Laseren høye retningen gir mer lokaliserte optogenetic stimulering enn bredt felt stimulering ved hjelp av kvikksølv eller Xenon lampe. Selv om laser belysning har allerede blitt brukt til optogenetics i tidligere studier, er spesielle oppsett som glassfiber, micromanipulator, og laser kilde, som kreves i de fleste tidligere studier. I denne protokollen, bruker vi en konvensjonell konfokalmikroskopi for lokale belysning. Siden konfokalmikroskop systemet er mye brukt, vil denne metoden åpner muligheten for å bruke høyere oppløsning optogenetics i mange laboratorier.
Protokollen har to kritiske punkter: larve disseksjon og laser makt. For det første, dersom hjernen, den ventrale nerve ledningen eller en motorisk nerve er skadet undeng disseksjon, vil larvene vise mindre eller ingen spontan peristaltiske bevegelser. Presisjon er derfor viktig, spesielt når du gjør et snitt på dorsal side med våren saks og fjerne indre organer med tang. Detaljer om disseksjon har vært rapportert tidligere 21. Dernest, dersom tilstrekkelig stimulering som skal oppnås, en laser-kraft på omtrent 0,1 ~ 1 mW / mm 2 for CHR2 eller en ~ 10 mW / mm 2 for NpHR er nødvendig. Vi evaluerte laser makt som total lys kraft under en objektiv delt av et beregnet areal for belysning. Vi målte den totale lys kraft ved hjelp av en strømmåler (mobiken, Sanwa MI Technos, Japan). Vi beregnet av belysningsarealet som sirkulære konstant ganger kvadratet av bølgelengden av laseren, noe som gir omtrent belyste området i diffraksjon grensen. Effektiv belysning strøm på prøven kan justeres ikke bare i kraft av laser-utgang, men også ved å endre skannehastighet og nummeneh av repetisjoner. Vi skannet laser med 20-100 μsec / pixel for 63 ganger. I tillegg er uttrykket nivået av optogenetics protein og mengden av ATR er også kritiske for stimulering effektivitet. Følgelig, hvis larver viste ingen optogenetic respons, bør følgende punkter kontrolleres og korrigeres: 1) laser makt (ved å optimalisere mikroskop system), 2) uttrykk nivået av optogenetics protein (ved å sjekke genotype og oppdra temperatur), og 3) mengden av ATR (ved å justere konsentrasjonen av ATR og mate periode). NpHR krever høyere konsentrasjon av ATR enn CHR2 gjør av ukjente grunner 13. CHR2 fungerer godt i larver alet opp i mat som inneholder mindre ATR (f.eks 0.1 mm) enn beskrevet her (1 mm). Som fôring larvene til en mM ATR er tilstrekkelig for å gjøre CHR2 foto-reaktive, anbefaler vi denne konsentrasjonen for den første rettssaken i CHR2 eksperimenter. Konsentrasjonen av ATR kan senere bli titrert ned fra 1 mm. Som til eksponering varighet for ATR, anbefaler vivarigheten er beskrevet her for robust optogenetic kontroll. Vi ofte ikke klarte å observere optogenetic respons når mate larvene til ATR for kortere varighet.
I denne protokollen, er laser belysning og bildeopptak drives av en egen datamaskin. Så, er klar påvisning av tid og rom mønster av laser belysning av CCD-kamera kritisk for dataanalyse. Hvis laser spot eller linjen er dim på CCD image, bør du optimalisere kraften av halogenpære og få verdien av CCD-kamera for å visualisere laser belysning mens du holder kroppen veggen synlig.
Spatiotemporal belysning vist i denne protokollen gir informasjon om larve motorkretser, men metoden har noen begrensninger. Hva angår "romlig" aspektet, plassering av belysningen måles ved lav forstørrelse CCD brukes for videotaping kroppsveggen bevegelser. Følgelig kan belysning område være tilordnet segment nivå, men ikke på cellenivå. Hva angår «temporal "aspektet, tidsforsinkelse mellom innkobling av laserskanning av konfokalmikroskop og belysning med laser er avhengig av konfokalmikroskop system og skanning tilstand. Følgelig er noen tester ved prøving og feiling er nødvendig å justere belysning timing. Siden tidspunktet for belysning kan fastsettes i CCD image filmer ved hjelp av tilstrekkelig programvare som ImageJ, er den kritiske faktoren i tidsmessig oppløsning bildefrekvens på CCD-kamera imaging. Vi vanligvis setter bildefrekvens for 7.5-15 bilder per sekund.
Fremskritt i optogenetic verktøy gir oss en sjanse til å endre denne protokollen. Vi brukte 3 rd instar larver besittelse OK6-Gal4 og UAS-CHR2 [H134R] eller UAS-NpHR2. Andre optogenetic verktøy i stedet for CHR2 [H134R] eller NpHR2 som CHR2 [T159C/E123T], NpHR3 eller Arch kan øke effektiviteten av aktivitet kontroll 22. I tillegg kan bruk av andre Gal4 linjer eller analyse i andre utviklingsstadier gi mer informasjon om motor circuits.
I denne protokollen, ble motorisk aktivitet overvåkes av overføring bilder av bodywall sammentrekning med en CCD-kamera. Aktiviteten av motoriske nerveceller med kalsium-sensitive fluorescens molekyler (f.eks GCaMP) kan også være direkte overvåket mens manipulere nevral aktivitet med CHR2 eller NpHR. I dette tilfellet blir blått lys belysning i et bredt område og en svært følsom CCD-kamera (f.eks EMCCD kamera) benyttes i stedet for en halogenlampe og den normale CCD-kamera som tidligere er beskrevet heri. For å forbedre romlig oppløsning på stimulering mens overvåking bodywall bevegelse, ved hjelp av en ekstra objektivlinse kan være en mer avansert metode: belysning av den ventrale nerve ledningen ved en høy forstørrelse objektivlinse (f.eks 40x) ovenfra prøven og overvåking bodywall ved lav forstørrelse linse (f.eks 4x) under prøven. Denne doble linsesystem kan tillate oss å stimulere nervesystemet i høyere romlig oppløsning.
<p class="Jove_content"> Protokollen vist her kan brukes på andre nevrale kretser, kan tilbys optogenetic verktøy uttrykkes i nervesystemet og forberedelse der tilstrekkelig lys kan leveres inn i nervevev kan etableres.The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Grant-i-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Mesoskopisk neurocircuitry" (nr. 22115002) og «Comprehensive Brain Science Network" (nr. 221S0003) i Kunnskapsdepartementet, Kultur, sport, vitenskap, og teknologi, Japan til AN og Grant-i-Aid for Unge Forskere (B) (nr. 21700344) av Japan Society for Promotion of Science (JSP) til HK
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |