間葉転換を誘導し、上皮の分析

。T98Gグリオブラストーマ細胞、HT29結腸腺癌細胞：ここで説明EMT誘導する培養条件は、種々の細胞型におけるEMTの誘導のためのロバストな方法を提供するA 1及びA 2は 4つの異なるヒト細胞株についての形態学およびマーカー発現レベルを実証する図 、A549肺癌細胞、およびMCF10A乳房上皮細胞。紡錘状の形態（ 図1E – 1H）、間葉に- EMTを誘引培地添加物で処理した細胞は、古典的な上皮形態（1D図1A）から変更。 EMT誘導した細胞は、非誘導細胞と比較してタイトなコロニーにパックあまり密集して現れた。非誘導MCF10Aサンプルはより緩く詰まった細胞に囲まれた密集したクラスタを含んでいた。これらの密集したクラスタ（ 図2D）E-カドヘリン陽性で、EMTを誘引メディア補遺での処理の際に姿を消したement（ 図2H）。 EMTはまた、上皮マーカーおよび間葉マーカーのアップレギュレーションのダウンレギュレーションによって評価した。 E-カドヘリン発現のダウンレギュレーションは、一般的に異なる細胞型3,4内のEMTの誘導後に観察されている。図2は、未処理細胞の大部分では、E-カドヘリンの表面発現を示す（ 図2A – 2D、赤）。その不在と比較した後にEMTの誘導（ 図2E – 2H、赤）。 One細胞株T98Gは、従来の分析を妨げEMT誘導にE-カドヘリンの非常に低い基礎レベルを有することが見出された。間葉系マーカー、フィブロネクチンのアップレギュレーションは、EMTを誘引培地補充（;緑- – 2D図2Eに対して2H図2A）で誘導した後にも見ることができた。 E-カドヘリンおよびフィブロネクチンの発現レベルは、免疫細胞化学から見たさらに、全細胞溶解物のウェスタンブロッティング（ 図3）を介して確認した。ウェスタンブロットは、E-カドヘリンおよび免疫細胞化学から見たフィブロネクチン発現のアップレギュレーションのダウンレギュレーションを確認した。バンドは、EMTの誘導後の相対倍数変化を決定するために、デンシトメトリーおよびGAPDHに正規化を使用して定量した。 E-カドヘリンレベルはそれぞれ、A549およびMCF10A細胞に6.4と3.4倍に減少した。フィブロネクチンのレベルは、それぞれ、4.1を4.6に増加し、2.3倍でT98G、A549、およびMCF10A細胞た。ウェスタンブロットは、ポストEMT誘導HT29細胞におけるE-カドヘリンタンパク質レベルの有意な低下を示していないが、免疫細胞の結果がで識別することができなくなる、E-カドヘリン（2Fに対して図2B）の表面発現の減少を実証全細胞溶解物のウェスタンブロット。 さらにEMTの状態、追加の既知のマーカーを評価するために、EMTのためのsが前後のEMT誘導を分析した。以前の結果と一致して、E-カドヘリンは、EMTを誘導したことを示す、調べた全ての細胞株において下方制御された。また、間葉系マーカーは、ビメンチンおよびカタツムリは、EMTを誘引培地添加物（ 図4）で処理した後、A549、T98G、およびMCF10A細胞でアップレギュレートされた。 HT29細胞株は、これらの細胞がEMTの誘導のための代替経路を利用することを示すことができるEMT誘導（データは示さず）の有無にかかわらず、これらのいずれかの間葉系マーカーの発現を示さなかった。 TGF-βは、特定の細胞においてEMTを誘導するのに十分である7,8,9のコンテキストが、他の細胞型は、TGF-βの添加14のみに応答しない。 MCF7ヒト乳癌細胞およびPANC-1ヒト膵臓癌細胞は、両方のTGF-β単独14シグナル伝達に応答しないことが報告されている。両方のラインがvitrで EMTを受けることができるかどうかを判断するにはO、細胞がEMTを誘引メディアサプリメントの存在下で培養した。細胞は、EMTを誘引培地添加​​物内の濃度で、単独の組換えTGF-β1で刺激した。これらの細胞は、E-カドヘリンレベルは対照細胞（ 図5Aおよび5Bに対して、図5Cおよび5D）に見られるものと同様であった密集した細胞のコロニー（データは示さず）および表面からなる、それらの上皮形態を保持していた。これとは対照的に、EMTを誘引培地添加物で刺激された細胞は、表面のE-カドヘリンのレベルの劇的な減少（ 図5Eと5F）を示した。細胞がより少なく、よりコンパクトになり、紡錘状（データは示さず）、これらの細胞はまた、より多くの間葉形態を得た。これらの結果は、ここで説明する方法は、EMT誘導EMT形態およびTGF-β-iを代表的に耐性の細胞におけるマーカー発現の変化を促進することができることを実証nduced EMT。 マーカー発現の変化に加えて、間葉細胞の別の特徴は、移動し、侵入する能力である。ととも​​に培養またはEMTを誘引培地補充なしで細胞の移動および浸潤は、製造業者の指示に従って、96ウェルBMEの細胞浸潤アッセイを用いて分析した。簡単に述べると、細胞を8.0ミクロンの細孔を有するフィルターインサートを含有する（50,000細胞/ウェル）を96ウェルプレートに播種した。 48時間後、遊走をフィルターを通して移動した細胞のAM染色をカルセインによって評価した。各サンプルは同様の結果で二回三重に試験した。一つの実験からの代表的結果を図6Aに示されている。細胞移動の統計学的に有意な増加（P値<0.003）がA549およびEMT誘導後PANC-1細胞の両方で見られた。 （ すなわち、細胞外マトリックスを通って移動）浸潤するこれらの細胞の能力を評価するために、同じアッセイであった基底膜抽出物でコーティングされたフィルターを用いて行った。 EMT-誘発された細胞は、 図6Bに示すように、未処理の細胞と比較して、浸潤能力において統計的に有意（P値<0.001）増加を示した。 EMTのロバストな誘導は、これらの細胞で起こる遺伝子発現の変化およびシグナリングの分析のために有用である。両方の処理および未処理細胞からの溶解物を用いた抗体ベースの配列解析は、単一のサンプル中の様々な分子の発現レベルを分析するための一つの方法である。例として、プロテオームプロファイラ人間ホスホ-MAPKアレイキットを使用した非誘導やEMT誘発性MCF7およびA549細胞由来の溶解物中のリン酸化MAPKファミリーのメンバーのレベルを分析した。配列は、同様の結果を独立したEMT誘導治療から2回実行されました。 図7は、1配列から代表的なデータを示しています。両方の細胞型は、CREB（S133）のリン酸化の増加を示し、ERK1（T2対照と比較して、EMT誘導細胞における02/Y204）、およびERK2（T185/Y187）。シグナル伝達事象における相違は、同様に2つの細胞型の間で観察された。 MCF7細胞は増加したp70S6K（T421/S424）リン酸化を示し、一方、A549細胞は、GSK-3β（S9）のリン酸化の増加を示した。 図1。 EMTを誘引培地添加物による刺激後の間葉の形態の誘導（A – D）。4の細胞型における上皮形態は、EMTを誘引培地添加物なしの標準培地中で5日間培養して、次の指示さ（E – H）での間葉モルフォロジー4つの細胞型は、5日間、EMTを誘引培地添加​​物とともに培養示した。 NT "FO：キープtogether.withinページ="常に "> 図2。上皮マーカーの発現とEMT誘導性細胞における間葉マーカー発現のアップレギュレーションのダウンレギュレーションは。細胞上皮マーカー、E-カドヘリン（赤）の発現を検出するための免疫蛍光法により染色し、間葉マーカーフィブロネクチン（緑色）。（A – D）5日間、EMTを誘引培地添加物なしで培養した対照細胞（E – H）5日間、EMTを誘引培地添加物で培養した細胞。すべての細胞をDAPI（青）で対比されています。 図3。ウェスタンブロットANと上皮および間葉マーカー発現の確認 （ – ）5日間、EMTを誘引メディアサプリメント4つの細胞型の全細胞溶解物のウェスタンブロットalysis（EMT）の有無にかかわらず処理され、示された。左側に示されているように、E-カドヘリン、フィブロネクチン、およびGAPDHローディングコントロールのためのバンドがあります。右側に示されているようにサイズマーカーです。 図4。間葉系マーカー、EMT誘導細胞におけるビメンチンとカタツムリのアップレギュレーションは。細胞は上皮マーカー、E-カドヘリン（グレー）の発現を検出するために、多色免疫蛍光法により染色し、間葉系マーカー、ビメンチン（緑）、かたつむり（赤） （A – C）5日間のEMTを誘引培地添加物なしで培養した対照細胞（D – F）5日間、EMTを誘引培地添加物で培養した細胞。 lways "> 図5。 TGF-β1非応答性細胞におけるEMTの誘導。（AとB）5日間、培地単独で培養された細胞。（CとD）5日間のTGF-β1の10 ng / mlのを含む培地で培養された細胞。（E 5日間、EMTを誘引培地添加物で培養し、F）細胞。すべての細胞は、E-カドヘリン発現（赤色）について染色およびDAPI（青）で対比されています。 図6。 EMT誘導した細胞は、遊走および浸潤能力を増加している。48時間インキュベーション後に8ミクロンの孔のフィルターに通して移動した細胞のA.平均数。B.の平均数48時間のインキュベーション後に基底膜抽出物でコーティングされた8ミクロンの孔のフィルターに通して侵入することができました細胞。エラーバーは3ウェル以上の標準偏差を示す。 EMT誘導の図7。抗体ベースのアレイ発現解析。 EMTを誘引メディア補助の有無にかかわらず培養したA549（AおよびC）からの溶解物およびMCF7（BおよびD）細胞は、ヒトプロテオームプロファイラホスホ-MAPKアレイキットを使用してアレイ分析に使用した。スポットはAで強調表示し、Bはその後、デンシトメトリーを用いて定量した。非誘導するEMT-誘発される溶解物の比較は、（CとD）下記の対応するバーグラフに表示されます。 大きな画像を<見るにはここをクリックしてください/>。