Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition
Summary
Ein einfaches Verfahren ist für die Induktion von epithelialen mesenchymale Transition (EMT) in einer Vielzahl von Zelltypen beschrieben. Methoden zur Analyse von Zellen in EMT-Staaten durch Immunzytochemie sind enthalten.
Abstract
Epitheliale mesenchymale Transition (EMT) ist für die richtige Morphogenese während der Entwicklung. Fehlregulation dieses Prozesses wurde als ein Schlüsselereignis in der Fibrose und der Progression von Karzinomen zu einem metastasierten Zustand gebracht worden. Das Verständnis der Prozesse, die EMT zugrunde liegen, ist für die Frühdiagnose und klinische Kontrolle dieser Krankheitszustände Imperativ. Zuverlässige Induktion der EMT in vitro ist ein nützliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung sowie zur gemeinsamen Genexpressionssignaturen für diagnostische Zwecke zu identifizieren. Hier zeigen wir ein einfaches Verfahren für die Induktion der EMT in einer Vielzahl von Zelltypen. Verfahren zur Analyse von Zellen, prä-und post-EMT-Induktion durch Immunzytochemie sind ebenfalls enthalten. Darüber hinaus zeigen wir die Wirksamkeit dieser Methode durch Antikörper-basierten Array-Analyse und Migration / Invasion Assays.
Introduction
Epitheliale mesenchymale Transition (EMT) ist der Prozess, durch den eine polarisierte Epithelzelle erfährt eine Vielzahl von Änderungen, die sich in einer sehr beweglich, Fibroblasten-ähnliche Zellen mesenchymalen. Dieser Prozess erfolgt zum Teil durch Veränderungen der Genexpression und der Degradation von Adhärenzverbindungen, was zu einer erhöhten Fähigkeit zu migrieren und zu erobern. Physiologisch EMT spielt eine wichtige Rolle während der embryonalen Entwicklung und Wundheilung. Verlust der Kontrolle über die richtige EMT kann zur Fibrose und Metastasierung von Karzinomen 1,2 führen.
Die Reduktion von E-Cadherin auf der Oberfläche der Epithelzellen ist ein kritischer Schritt in der Progression einer Zelle durch EMT 3,4. E-Cadherin ist ein Single-Pass-Transmembranprotein, das direkt mit Cadherin Proteine auf benachbarten Zellen interagiert. Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Zelladhäsion, E-Cadherin Einflüsse Zellsignalisierung über Wechselwirkungen zwischen dem zytoplasmatischen Schwanz von E-Cadherin einda Vielzahl von regulatorischen Proteinen, insbesondere β-Catenin. β-Catenin spielt eine Rolle bei der Stabilisierung der Adhärenzverbindungen. Während der Wnt-Signalisierung wird β-Catenin von E-Cadherin freigegeben und an den Kern, wo es als ein Transkriptionsfaktor, der stromabwärts des Wnt-Signalwegs 3,4,5 wirkt transloziert. Im Zellkern ist β-Catenin wurde gezeigt, dass die Transkription von mehreren EMT bezogene Faktoren wie Twist, Slug, Fibronektin, und eine Vielzahl von Matrix-Metalloproteasen 3,6 zu erhöhen.
Neben Wnts hat TGF-β Signal gezeigt worden, um eine bedeutende Rolle bei EMT Induktion sowohl während der normalen Entwicklung und bei Krankheitszuständen 7,8,9 spielen. TGF-β ist in der EMT, die während der Gaumen Bildung und in der Entwicklung von Herz 10 tritt beteiligt. Es hat sich auch in Fibrose und in der Krebsprogression zur Metastasierung 7 in Verbindung gebracht.
Das hier beschriebene Verfahren provides konsistente Induktion der EMT in einer Vielzahl von Zelltypen ohne genetische Manipulation. Dieses Verfahren verwendet eine Mischung aus E-Cadherin, sFRP-1 und Dkk-1-blockierende Antikörper und Wnt-5a und TGF-β1 rekombinanten Proteinen. Dieser Cocktail ist für die E-Cadherin-basierten Haftung zu blockieren und gleichzeitig die Wnt-und TGF-β-Signalisierung. Die Fähigkeit für robuste EMT Induktion ist entscheidend für das Verständnis der Biologie dieser Prozess und wie man sie für therapeutische Zwecke zu manipulieren. Strom gemeinsam Marker der EMT, E-Cadherin (in EMT herunterreguliert) und Vimentin (in EMT hochreguliert), können gefunden werden in Krebs co-exprimiert und somit nicht bieten die besten Diagnosemarker von potentiellen metastatischen Zellen 12. Wichtiger ist, ist die Analyse von einer Vielzahl von Zelltypen, EMT laufen haben nützliche gemeinsame Genexpression Signaturen, die für diagnostische Zwecke bei Krebs und Fibrose 11 eingesetzt werden können. Zusätzlich haben neuere Studien gezeigt, dass EMT kann eine Rolle bei der Bildung von Krebs-Stammzellen zu spielen, was darauf hindeutet, dass Zellen, die EMT durchlaufen haben kann für Wirkstoff-Screening sein, um Verbindungen, die diese Zielzellen kann 13 zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bisherige Verfahren zur Induktion EMT haben im Allgemeinen verwendet, TGF-β Stimulation oder genetische Veränderung. Obwohl TGF-β allein hat sich gezeigt, EMT in einigen Zelltypen induzieren, wurde nun gezeigt, dass TGF-β für EMT notwendig ist, aber es genügt nicht in allen Zelltypen 6,14. Mit genetischen Modifikation für EMT Induktion ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Kombination von Faktoren, einschließlich, Anti-Human-E-Cadherin-, anti-human sFRP-1, Anti-Human-Dkk-1, rekombinantes humanes Wnt-5a und rekombinantes menschliches TGF-β1, zuverlässig herbei EMT. Diese Kombination von Faktoren ist für die E-Cadherin-basierten Haftung, einen entscheidenden Schritt für EMT Induktion 4 zu blockieren, und verbessern Wnt-Signalweg durch Hinzufügen des Wnt-5a-Protein als auch mit blockierende Antikörper gegen den Wnt-Inhibitoren, sFRP-1 und Dkk -1. Wnt-und TGF-β-Signalisierung wurde gezeigt, dass in einer autokrinen Schleife dienen zur Einleitung und Aufrechterhaltung der mesenchymalen Zell state 6. Dieses Verfahren vermeidet Induktions Genmanipulation und ist effektiver als die Verwendung von TGF-β allein. Wichtig ist, dass wir in der Lage, die Induktion der EMT in Zelltypen zu beobachten, einschließlich MCF7 und PANC-1-Zellen, die zuvor gezeigt wurde, nicht nur auf die TGF-β Stimulation reagieren (Fig. 5) 14.
Zellen mit EMT-Inducing Medien Supplement zeigen weniger kompakt und erhöhte spindelförmige Morphologie (Abbildung 1) behandelt. Zusätzlich gibt es eine Abnahme der Oberflächen E-Cadherin-Expression gleichzeitig mit einem Anstieg der Fibronektin, das Markenzeichen von EMT (Fig. 2 und 3) sind. Zusätzliche mesenchymalen Marker wie Vimentin und Schnecke sind auch in den EMT induzierten Zellen im Vergleich zu nicht-induzierten Kontrollen (Fig. 4) hochreguliert. Erhöhte Migration und Invasion Fähigkeiten sind die wichtigsten Funktionsmerkmale von mesenchymalen Zellen. In in vitro </em> Migration und Invasion Assays Zellen mit EMT-Inducing Medien Supplement behandelt wurden, zeigten eine deutlich erhöhte Kapazität zur Migration und dringen (Abbildung 6).
Diese einfache Methode zur Induktion EMT ist nützlich für die Untersuchung der EMT Signalgebung mit den Antikörperarray-Expressionsdaten in Fig. 7 gezeigt, dargestellt. Verschiedene Zelltypen können pre-und post-EMT Induktions verglichen werden, um gemeinsame Expression Signaturen mit EMT verbunden sind, wie die Erhöhung der phosphorylierte CREB und ERK1 / 2 in sowohl MCF7 und A549 EMT-induzierten Zellen gesehen zu erhalten. S133 Phosphorylierung von CREB stimuliert die DNA-Bindung und hat sich gezeigt, stromabwärts von TGF-β1-induzierten EMT 15 zu wirken. ERK1 / 2 Phosphorylierung wurde auch gezeigt, stromabwärts von TGF-β1-induzierten EMT 16 zu wirken. Unterschiede in der Signalwege zwischen den Zellen-Typen können auch erläutert, wie mit der Zunahme der GSK-3β-Phosphorylierung in A549 Zellen gegenüber p70S6 sehenK-Phosphorylierung in MCF7. GSK-3β-Phosphorylierung an Serin 9 verringert sie Funktion und GSK-3β ist gezeigt worden, um die pro-EMT-Transkriptionsfaktor, Schnecke 17 zu verhindern. Im Gegensatz dazu induziert p70S6K Snail Tätigkeit und deren Phosphorylierung wird mit der Aktivierung dieses Proteins 18 zugeordnet.
Insgesamt einfache und sichere Induktion der EMT, insbesondere in bisher nicht gezeigt, um sich ausschließlich auf TGF-β-Zellen reagieren, ist für das Verständnis der Biologie von EMT, Festlegung gemeinsamer Ausdruck Signaturen für die Verwendung als prognostische Marker, und die Entwicklung und Evaluierung neuer Therapeutika für Krebs und fibrotischer Erkrankung.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Julia und Martin Hatler Ramsden (R & D Systems) für hilfreiche Diskussionen und Manuskript Kritik bestätigen.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
| EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
| Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
| Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
| Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
| Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
| Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
| Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
| Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
| EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
| 96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
| Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
| Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| 95% Ethanol | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
| DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
| Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
| 12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
| Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
| TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
| PVDF Membrane | For western blotting | ||
| 4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
| ECL substrate | For western blotting | ||
| 15 ml conical tubes | |||
| Plates/flasks, tissue culture treated | |||
| 24-well plates, tissue culture treated | |||
| Pipettes / pipette tips | |||
| Pipet Aid / pipets | |||
| Hemocytometer | |||
| 37 °C Water Bath | |||
| 37 °C/5%CO2 Incubator | |||
| Centrifuge | |||
| Inverted light microscope | |||
| Fluorescence microscope |
Referências
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Thiery, J. P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).
- Heuberger, J., Birchmeier, W. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).
- Onder, T. T. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Pesquisa do Câncer. 68, 3645-3654 (2008).
- Tian, X. E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).
- Scheel, C. Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell. 145, 926-940 (2011).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Research. 19, 156-172 (2009).
- Kasai, H. TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition. EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).
- Miettinen, P. J., et al. TGF-β induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).
- Pelton, R. W., et al. Differential expression of genes encoding TGFs β1, β2, and β3 during murine palate formation. Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).
- Taube, J. H. Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes. PNAS. 107, 15449-15454 (2010).
- Roussos, E. T., et al. AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment. Pesquisa do Câncer. 70, 7360-7364 (2010).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).
- Brown, K. A. Induction by transforming growth factor-β1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro. Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).
- De Falco, V., et al. CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells. Pesquisa do Câncer. 72, 1449-1458 (2012).
- Xie, L. Activation of the Erk pathway is required for TGF-β1-induced EMT in vitro. Neoplasia. 6, 603-610 (2004).
- Bachelder, R. E., et al. Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).
- Pon, Y. L. p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells. Pesquisa do Câncer. 68, 6524-6532 (2008).
- Wegner, G. J., et al. Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays. J. Vis. Exp. , (2012).
