Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie
Summary
Een eenvoudige werkwijze beschreven voor de inductie van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) in verschillende celtypen. Methoden voor de analyse van cellen in EMT toestanden met immunocytochemie inbegrepen.
Abstract
Epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) is essentieel voor een goede morfogenese tijdens ontwikkeling. Misregulation dit proces is betrokken als een belangrijke gebeurtenis in fibrose en progressie van carcinomen een metastatische toestand. Inzicht in de processen die ten grondslag liggen EMT is absoluut noodzakelijk voor de vroege diagnose en klinische controle van deze ziektebeelden. Betrouwbare inductie van EMT in vitro is een nuttig hulpmiddel voor drug discovery alsmede gemeenschappelijke genexpressie handtekeningen identificeren voor diagnostische doeleinden. Hier laten we een eenvoudige werkwijze voor de inductie van EMT in verschillende celtypen. Werkwijzen voor de analyse van cellen voor en na EMT-inductie door immunocytochemie zijn ook inbegrepen. Daarnaast hebben we de effectiviteit van deze werkwijze tonen door antilichamen gebaseerde array analyse en migratie / invasie assays.
Introduction
Epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) is het proces waarbij een gepolariseerde epitheliale cel ondergaat diverse wijzigingen resulteert in een zeer beweeglijke, fibroblast-achtige mesenchymale cellen. Dit proces treedt op, ondermeer met genexpressie veranderingen en afbraak van contactplaatsen, hetgeen resulteert in een toegenomen vermogen om te migreren en binnendringen. Fysiologisch, EMT speelt een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling en wondheling. Verlies van een goede controle over de EMT kan leiden tot fibrose en metastase van carcinomen 1,2.
De reductie van E-cadherine op het oppervlak van epitheelcellen is een kritische stap bij de progressie van een cel door EMT 3,4. E-cadherine is een single-pass transmembraan eiwit dat direct met cadherin eiwitten op aangrenzende cellen. Naast zijn rol bij celadhesie, E-cadherine invloeden cel signalering via interacties tussen de cytoplasmatische staart van E-cadherine eenda verscheidenheid van regulerende eiwitten, met name β-catenine. β-catenine speelt een rol bij de stabilisering van contactplaatsen. Tijdens Wnt signalering, is β-catenine model van E-cadherine en translocatie naar de kern waar het als een stroomafwaartse transcriptiefactor in de Wnt route 3,4,5. In de kern is β-catenine is aangetoond dat de transcriptie van verscheidene EMT-gerelateerde factoren Twist, slak, fibronectine, en een verscheidenheid van matrix metalloproteasen 3,6 te verhogen.
Naast Wnts heeft TGF-β signalering blijkt een belangrijke rol spelen bij EMT inductie zowel tijdens normale ontwikkeling en in zieke toestanden 7,8,9. TGF-β betrokken bij de EMT die optreedt tijdens verhemelte en in het ontwikkelen van hart 10. Het is ook betrokken bij fibrose en progressie van kanker metastase 7.
De hier beschreven procedure provides consistente inductie van EMT in verschillende celtypen zonder genetische manipulatie. Deze procedure maakt gebruik van een cocktail van E-cadherine, sFRP-1 en DKK-1 blokkerende antilichamen en Wnt-5a en TGF-β1 recombinante eiwitten. Deze cocktail is ontworpen om E-cadherine-gebaseerde hechting te blokkeren terwijl het verbeteren van Wnt en TGF-β signalering. De mogelijkheid voor robuuste EMT inductie is van cruciaal belang voor het begrijpen van de biologie van dit proces en hoe het te manipuleren voor therapeutische doeleinden. Huidige gemeenschappelijke markers van EMT, E-cadherine (downregulated in EMT) en Vimentin (upregulated in EMT), vindt co-expressie bij kanker en dus niet de beste diagnostische markers van mogelijke metastatische cellen 12. Belangrijk is dat de analyse van diverse celtypen die EMT hebben ondergaan nuttig gemeenschappelijke genexpressie handtekeningen die worden gebruikt voor diagnostische doeleinden bij kanker en fibrose 11 ontwikkelen. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat EMT kan een rol spelen bij de vorming van kanker cellen, wat suggereert dat cellen die EMT hebben ondergaan nuttig voor drug screening zijn verbindingen die deze cellen kan richten 13 identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vorige werkwijzen voor EMT inductie het algemeen gebruikt TGF-β stimulatie of genetische modificatie. Hoewel TGF-β alleen is aangetoond EMT induceren in sommige celtypen, werd nu aangetoond dat TGF-β noodzakelijk voor EMT, maar het is niet voldoende alle celtypen 6,14. Het gebruik van genetische modificatie voor EMT inductie is tijdrovend en arbeidsintensief. De hier beschreven methode gebruikt een combinatie van factoren, anti-humane E-cadherine, anti-humaan sFRP-1, anti-humaan DKK-1, recombinant humaan Wnt-5a en recombinant humaan TGF-β1 betrouwbaar EMT induceren. Deze combinatie van elementen is ontworpen om E-cadherine basis hechting, een kritische stap voor EMT inductie 4 blokkeren en verbeteren Wnt signalering door toevoeging van de Wnt-5a-eiwit alsmede het gebruik van blokkerende antilichamen tegen de Wnt remmers, sFRP-1 en Dkk -1. Wnt en TGF-β signalering is aangetoond dat zij in een autocriene lus voor inductie en handhaven de mesenchymale cel state 6. Deze inductiemethode voorkomt genetische manipulatie en is effectiever dan het gebruik TGF-β alleen. Belangrijk, kunnen wij inductie van EMT observeren celtypen, waaronder MCF7 en PANC-1 cellen, die eerder aangetoond niet alleen reageren op TGF-β stimulatie (figuur 5) 14.
Cellen behandeld met EMT Induceren Media Supplement toon minder compact en meer spoelvormige morfologie (figuur 1). Daarnaast is er een afname in oppervlak E-cadherine gelijktijdig met een verhoging van fibronectine expressie, die kenmerken van EMT (figuren 2 pt 3) zijn. Aanvullende mesenchymale merkers zoals vimentine en slak ook opgereguleerd in de EMT geïnduceerde cellen in vergelijking met niet-geïnduceerde controles (Figuur 4). Toegenomen migratie en invasie vaardigheden zijn de belangrijkste functionele kenmerken van mesenchymale cellen. In in vitro </em> Migratie en invasie assays cellen behandeld met EMT Induceren Media Supplement toonde een aanzienlijk verhoogde capaciteit te migreren en binnendringen (figuur 6).
Deze eenvoudige werkwijze voor EMT inductie is nuttig voor de studie van EMT signalering zoals aangetoond met het antilichaam-array expressie uit figuur 7. Verschillende celtypes kunnen pre-en post-EMT inductie vergeleken gemeenschappelijk expressie handtekeningen verbonden EMT, zoals de toename van gefosforyleerde CREB en ERK1 / 2 gezien in zowel MCF7 en A549-EMT geïnduceerde cellen te verkrijgen. S133 fosforylatie van CREB stimuleert DNA binding en is getoond stroomafwaarts van TGF-β1-geïnduceerde EMT 15 handelen. ERK1 / 2 fosforylering is ook aangetoond stroomafwaarts van TGF-β1-geïnduceerde EMT 16 handelen. Verschillen in signaalwegen tussen celtypen kan worden toegelicht zoals gezien met de toename van GSK-3β fosforylatie in A549-cellen versus p70S6K fosforylatie in MCF7. GSK-3β fosforylatie bij serine 9 verlaagt functie en GSK-3β is aangetoond dat het pro-EMT transcriptiefactor Snail 17 remmen. Daarentegen induceert p70S6K activiteit Slak en de fosforylering is geassocieerd met activatie van dit eiwit 18.
Algemene, eenvoudige en betrouwbare inductie van EMT, met name in de cellen eerder aangetoond niet te reageren uitsluitend TGF-β, is nuttig voor het begrijpen van de biologie van EMT, het identificeren van gemeenschappelijke uitdrukking handtekeningen voor gebruik als prognostische markers, en het ontwikkelen en evalueren van nieuwe therapieën voor kanker en fibrotische ziekten.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Julia Hatler en Martin Ramsden (R & D Systems) erkennen voor nuttige discussie en manuscript beoordeling.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
| EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
| Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
| Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
| Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
| Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
| Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
| Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
| Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
| EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
| 96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
| Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
| Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| 95% Ethanol | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
| DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
| Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
| 12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
| Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
| TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
| PVDF Membrane | For western blotting | ||
| 4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
| ECL substrate | For western blotting | ||
| 15 ml conical tubes | |||
| Plates/flasks, tissue culture treated | |||
| 24-well plates, tissue culture treated | |||
| Pipettes / pipette tips | |||
| Pipet Aid / pipets | |||
| Hemocytometer | |||
| 37 °C Water Bath | |||
| 37 °C/5%CO2 Incubator | |||
| Centrifuge | |||
| Inverted light microscope | |||
| Fluorescence microscope |
Referências
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Thiery, J. P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).
- Heuberger, J., Birchmeier, W. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).
- Onder, T. T. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Pesquisa do Câncer. 68, 3645-3654 (2008).
- Tian, X. E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).
- Scheel, C. Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell. 145, 926-940 (2011).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Research. 19, 156-172 (2009).
- Kasai, H. TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition. EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).
- Miettinen, P. J., et al. TGF-β induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).
- Pelton, R. W., et al. Differential expression of genes encoding TGFs β1, β2, and β3 during murine palate formation. Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).
- Taube, J. H. Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes. PNAS. 107, 15449-15454 (2010).
- Roussos, E. T., et al. AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment. Pesquisa do Câncer. 70, 7360-7364 (2010).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).
- Brown, K. A. Induction by transforming growth factor-β1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro. Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).
- De Falco, V., et al. CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells. Pesquisa do Câncer. 72, 1449-1458 (2012).
- Xie, L. Activation of the Erk pathway is required for TGF-β1-induced EMT in vitro. Neoplasia. 6, 603-610 (2004).
- Bachelder, R. E., et al. Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).
- Pon, Y. L. p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells. Pesquisa do Câncer. 68, 6524-6532 (2008).
- Wegner, G. J., et al. Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays. J. Vis. Exp. , (2012).
