诱导上皮和分析间质转化

，此处所描述的EMT诱导培养条件下提供一种可靠的方法用于诱导EMT的多种细胞类型中的图1和图2展示的形态学和标记物表达水平为4种不同的人细胞系：T98G胶质瘤细胞，HT29结肠腺癌细胞，A549肺癌细胞，并MCF10A乳腺上皮细胞。这是与EMT的诱导培养基添加剂处理过的细胞从传统的上皮形态（ 图1A – 1D）变更为间质，纺锤状形态（ 图1E – 1H）。 EMT诱导的细胞似乎不太密集的排布紧密的殖民地相比，未诱导的细胞。未诱导MCF10A样本含有由多个松散的细胞包围排列紧密的集群。这些紧凑团簇的E-cadherin蛋白阳性（ 图2D），消失在治疗EMT的诱导培养基增刊键相（ 图2H）。 EMT还评估了上皮标记和间质标记物的表达上调下调。 E-cadherin表达的下调通常观察到在不同的细胞类型3,4以下的EMT诱导图2展示了E-cadherin蛋白的表面表达在大部分未经处理的细胞（ 图2A – 2D，红色）。相比，它的缺席后EMT的诱导（ 图2E – 2H;红色）。一个细胞系，T98G，发现有E-cadherin的前EMT的诱导，这排除了其分析的一个非常低的基础水平。间充质标志物，纤维连接蛋白的上调，也可见诱导EMT的诱导培养基添加剂（ 图2A – 2D与图2E – 2H;绿色）之后。 E-钙粘蛋白和纤维连接蛋白的表达水平见过用免疫细胞化学通过总细胞裂解物的蛋白质印迹（ 图3）被进一步证实。免疫印迹证实E-cadherin蛋白和纤维连接蛋白的表达看到的免疫细胞化学的上调下调。该乐队是用密度和标准化为GAPDH，以确定相对倍数变化下的EMT诱导定量。 ，E-cadherin蛋白水平分别降低6.4和3.4倍，在A549和MCF10A细胞分别。纤连蛋白水平增加4.6，4.1和2.3倍，T98G，A549，和MCF10A细胞。虽然印迹不显示在HT29细胞后诱导EMT显著减少E-钙粘蛋白的水平，该免疫细胞化学结果表明在E-钙粘蛋白（ 图2B与2F），这是无法在加以区别的表面表达减少总细胞裂解物的免疫印迹。 为了进一步评估EMT的状态，其他已知的标记S代表EMT分析前和后的EMT诱导。与以前的结果，E-cadherin的表达下调在检查了所有的细胞系，这表明EMT的诱导。此外，间充质标志物，波形蛋白和蜗牛，以下的处理与EMT诱导培养基补充剂（ 图4）被上调在A549，T98G，并MCF10A细胞。在HT29细胞系中没有显示出的这些间质标记物具有或不具有EMT诱导表达（数据未显示），这可能表明，这些细胞利用为EMT诱导替代途径。 尽管TGF-β是足以诱导EMT的某些细胞上下文7,8,9，其它细胞类型不完全去除了TGF-β14的响应。 MCF7人乳腺癌细胞和胰腺癌细胞系PANC-1人胰腺癌细胞中都报道不向TGF-β的单独信令14作出响应。要确定是否这两条线可能在VITR经历EMTO，细胞培养的EMT诱导培养基添加剂的存在。细胞用重组单独TGF-β1，在EMT诱导培养基补充内的浓度。这些细胞保留了上皮形态，组成细胞的紧密包装的菌落（数据未示出）和表面的E-钙粘蛋白水平相似，看到在对照细胞（ 图5C和图5D与图5A和5B）。与此相反，细胞EMT的诱导培养基补充刺激呈现在表面E-cadherin蛋白水平的显着降低（ 图5E和5F）。这些细胞也得到更多的间充质的形态，如细胞变少紧凑和更纺锤状（数据未显示）。这些结果表明，这里所描述的EMT诱导方法能够促进EMT的形态，通常以TGF-β-I抗性标记物的表达变化在细胞EP3受体激动剂诱导的EMT。 除了改变标志物表达，间充质细胞的另一特点是他们的迁移和侵袭能力。迁移和侵袭的细胞具有或不具有EMT诱导培养基补充，根据制造商的说明使用96孔BME细胞侵袭测定，分析培养的。简言之，将细胞接种到96孔板（50,000细胞/孔）含有过滤器滤芯具有8.0微米的孔隙。 48小时后，迁移是由钙黄绿素在曾透过过滤器迁移细胞的AM染色评估。将每个样品一式三份，结果相似测试两次。从一个实验的代表性结果示于图6A中 。统计学显著增加（P值<0.003），在细胞迁移被认为与以下EMT诱导既A549和PANC-1细胞。为了评估这些细胞的侵入（ 即迁移至细胞外基质）的能力，在相同的测定是与基底膜提取物涂布的过滤器进行。 EMT诱导的细胞表现出统计学显著性（P值<0.001）增加侵袭能力相比，未经处理的细胞， 如图6B所示。 鲁棒诱导EMT的是用于基因表达的改变和信令发生在这些细胞中的分析是有用的。使用来自两个处理过的和未处理的细胞裂解物的基于抗体阵列分析是一种方法来分析单个样品的各种分子的表达水平。作为一个例子，我们分析的磷酸化MAPK家族成员的水平裂解物从非诱导的和EMT诱导的MCF7和A549细胞用蛋白质组探查人类磷酸化MAPK阵列试剂盒。该数组是从具有相似结果的独立的EMT诱导处理执行两次。 图7示出了从一个阵列的代表性数据。这两种类型的细胞表现出CREB（S133）的磷酸化增加，ERK1（T2 02/Y204）和ERK2（T185/Y187）在EMT诱导的细胞与对照组相比。在信号转导事件的差异两种细胞类型之间进行观察，以及。 A549细胞显示增加GSK-3β（S9）的磷酸化，而MCF7细胞呈增加的p70S6K（T421/S424）的磷酸化。 图1。刺激EMT的诱导培养基补充后的间充质形态感应（A – D）上皮的四个类型的细胞形态显示，连续5天在标准培养基不EMT的诱导培养基补充以下文化（E – H）。间充质的形态四种细胞类型的表示与EMT的诱导培养基补充培养5天。 NT“FO：保持together.within页=”总是“> 图2。上皮细胞标志物的表达，并在EMT诱导骨髓间充质细胞标志物表达的上调下调。细胞免疫荧光染色检测上皮标志物E-钙粘蛋白（红色）的表达，以及间质标记物，纤维连接蛋白（绿色）（A – D）控制细胞无EMT的诱导培养基补充培养5天（E – H）细胞的EMT的诱导培养基补充培养5天。所有细胞经DAPI染色（蓝色）。 图3。用免疫印迹的上皮细胞和间充质标志物表达的确认 。四个类型的细胞的总细胞裂解物的alysis Western印迹表明，与（EMT）或不处理（ – ）的EMT诱导培养基补充5天。频段的E-钙粘蛋白，纤连蛋白和GAPDH的装载控制是如左图所示。的大小标记物是，如右图所示。 图4。的间充质标志，波形蛋白和蜗牛在EMT诱导细胞上调。细胞的多色免疫荧光染色检测上皮标志物E-钙粘蛋白（灰色）的表达，以及间质标记，波形蛋白（绿色）和蜗牛（红） （A – C）控制细胞无EMT的诱导培养基补充剂培养5天。（D – F）细胞的EMT的诱导培养基补充培养5天。 lways“> 图5。诱导EMT的TGF-β1无响应的细胞。（A和B）的细胞与单媒体培养5天。（C和D）细胞在含TGF-β1的10毫微克/毫升，连续5天培养基。（E和F）中的EMT诱导培养基补充5天培养的细胞。所有的细胞被染色的E-cadherin的表达（红色）和经DAPI染色（蓝色）。 图6。 EMT诱导的细胞增加了迁移和侵袭能力。细胞培养后通过8微米孔径的过滤器，迁移48小时的A.平均数。的B.平均人数细胞能够通过侵入培养48小时后涂基底膜提取物8微米孔径的过滤器。误差棒表示超过3个孔的标准偏差。 EMT诱导的图7。基于抗体的阵列表达分析。从A549（A和C）裂解液和MCF7（B和D）细胞有或无的EMT诱导培养基培养补充被用于利用蛋白质组探查人类磷酸激酶试剂盒阵列阵列分析。 的景点，突出和 B，然后使用密度定量。未诱导EMT诱导裂解的比较显示在下面（C和D）中相应的柱状图。 点击这里查看大图</ A>。