الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل
Summary
يوصف طريقة واضحة لتحريض الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وترد وسائل لتحليل الخلايا في الدول EMT بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية.
Abstract
الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) أمر ضروري لالتشكل السليم خلال التنمية. Misregulation من هذه العملية وقد تورط كحدث رئيسي في تليف وسرطان تطور إلى حالة النقيلي. فهم العمليات التي تكمن وراء EMT يتحتم على التشخيص المبكر والسيطرة السريرية لهذه الحالات المرضية. الحث موثوقة من EMT في المختبر هو أداة مفيدة لاكتشاف المخدرات وكذلك لتحديد التوقيعات التعبير الجيني المشترك لأغراض التشخيص. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة واضحة لتحريض EMT في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وترد أيضا أساليب لتحليل الخلايا ما قبل وما بعد EMT-تحريض من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر مدى فعالية هذه الطريقة من خلال تحليل مجموعة القائم على الأجسام المضادة والمقايسات الهجرة / الغزو.
Introduction
الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) هو العملية التي الخلايا الظهارية الاستقطاب يخضع لمجموعة متنوعة من التغيرات الناتجة في زنزانة الوسيطة متحركة عالية مثل الخلايا الليفية. تحدث هذه العملية، في جزء منه، من خلال التغيرات في التعبير الجيني وتدهور تقاطعات الملتصقة، مما أدى إلى زيادة القدرة على الهجرة وغزو. من الناحية الفسيولوجية، EMT تلعب أدوارا هامة أثناء التطور الجنيني والتئام الجروح. فقدان السيطرة المناسبة على EMT يمكن أن يؤدي إلى تليف وورم خبيث من سرطان 1،2.
الحد من E-كادهيرين على سطح الخلايا الظهارية هو خطوة حاسمة في تطور خلية من خلال EMT 3،4. E-كادهيرين هو بروتين الغشاء تمرير واحد التي تتفاعل مباشرة مع البروتينات على الخلايا المجاورة كادهيرين. بالإضافة إلى دورها في التصاق الخلية، E-كادهيرين خلية التأثيرات إشارة عبر التفاعلات بين الذيل حشوية من E-كادهيرين ودا متنوعة من البروتينات التنظيمية، ولا سيما β-catenin. β-catenin يلعب دورا في تحقيق الاستقرار في تقاطعات الملتصقة. خلال إشارات Wnt الكنسي، ويتم تحريرها β-catenin من E-كادهيرين وtranslocated إلى النواة حيث انها بمثابة عامل النسخ المصب في مسار 3،4،5 WNT. في النواة، وقد تبين β-catenin لزيادة النسخ لعدة عوامل ذات الصلة بما في ذلك EMT تويست، سبيكة، فيبرونكتين]، ومجموعة متنوعة من metalloproteases مصفوفة 3،6.
بالإضافة إلى WNTS، وقد تبين TGF-β إشارات للعب دورا هاما في EMT الحث على حد سواء خلال التطور الطبيعي في الدول المريضة و7،8،9. وتشارك TGF-β في EMT التي تحدث أثناء تشكيل الحنك وفي قلب النامية 10. كما تم المتورطين في تليف وسرطان في التقدم إلى ورم خبيث 7.
الإجراء الموضح هنا العلاقات العامةovides الاستقراء ثابت من EMT في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا دون الحاجة للتلاعب الجيني. يستخدم هذا الإجراء مزيج من E-كادهيرين، sFRP-1، وDKK-1 منع الأجسام المضادة وWNT-5A والبروتينات المؤتلف TGF-β1. تم تصميم هذا الكوكتيل لمنع E-المستندة إلى كادهيرين التصاق مع تعزيز WNT وTGF-β الإشارة. القدرة على الاستقراء EMT قوية هو أمر حاسم لفهم بيولوجيا هذه العملية وكيفية التعامل مع ذلك لأغراض علاجية. علامات الموحد الحالي للEMT، E-كادهيرين (downregulated في EMT) وVimentin (upregulated في EMT)، ويمكن الاطلاع أعرب المشارك في أمراض السرطان وبالتالي لا توفر أفضل علامات التشخيص من الخلايا المتنقل المحتملة 12. الأهم من ذلك أن تحليل مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا التي خضعت EMT هو مفيد لتطوير التوقيعات التعبير الجيني الشائعة التي يمكن أن تستخدم لأغراض التشخيص في السرطان والتليف 11. بالإضافة إلى ذلك، وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن EMT قد تلعب دورا في تشكيل الخلايا الجذعية السرطانية، مما يشير إلى أن الخلايا التي خضعت EMT قد تكون مفيدة لفحص المخدرات لتحديد المركبات التي يمكن أن تستهدف هذه الخلايا 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب السابقة لEMT الحث والتحفيز تستخدم عادة TGF-β أو التعديل الوراثي. على الرغم من TGF-β وحدها وقد تبين للحث على EMT في بعض أنواع الخلايا، وقد تم الآن ثبت أن TGF-β ضروري لEMT، ولكنها ليست كافية في جميع أنواع الخلايا 6،14. باستخدام التعديل الوراثي للEMT الاستقراء هو مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم مزيجا من العوامل من بينها، ومكافحة الإنسان E كادهيرين، sFRP-1 مكافحة الإنسان، ومكافحة الإنسان DKK-1، المؤتلف الإنسان WNT-5A، والمؤتلف الإنسان TGF-β1 للحث موثوق EMT. تم تصميم هذا المزيج من العوامل لمنع التصاق القائم E كادهيرين، خطوة حاسمة للتحريض EMT 4، وتعزيز الإشارات WNT بإضافة البروتين WNT-5A وكذلك باستخدام الأجسام المضادة ومنع لمثبطات WNT، sFRP-1 وDKK -1. وقد ثبت WNT وTGF-β إشارات التصرف في حلقة autocrine للحث والحفاظ على القانون الأساسي الخلية الوسيطةه 6. هذه الطريقة الحث يتجنب التلاعب الجيني وأكثر فعالية من استخدام TGF-β وحدها. الأهم من ذلك، نحن قادرون على مراقبة تحريض EMT في أنواع الخلايا، بما في ذلك MCF7 وPANC-1 الخلايا، التي ثبت سابقا عدم الرد فقط لتحفيز-TGF β (الشكل 5) 14.
الخلايا المعالجة مع الملحق المعرض EMT الإقناع وسائل الإعلام التشكل على شكل مغزل أقل إحكاما وزيادة (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، هناك انخفاض في سطح كادهيرين E التعبير المتزامنة مع زيادة في فبرونيكتين التعبير، والتي هي السمات المميزة لEMT (الشكلين 2 و 3). وupregulated علامات الوسيطة إضافية مثل Vimentin والحلزون أيضا في الخلايا التي يسببها EMT بالمقارنة مع الضوابط uninduced (الشكل 4). زيادة الهجرة والغزو قدرات هي الخصائص الفنية الرئيسية لخلايا اللحمة المتوسطة. في في المختبر </em> الهجرة والغزو المقايسات، الخلايا المعالجة مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام أظهرت زيادة كبيرة في القدرة على الهجرة وغزو (الشكل 6).
هذه طريقة بسيطة لEMT الاستقراء هو مفيد لدراسة EMT الإشارات كما هو موضح باستخدام بيانات التعبير مجموعة الضد هو مبين في الشكل 7. أنواع مختلفة من الخلايا يمكن مقارنة قبل وبعد EMT-التعريفي للحصول على التوقيعات التعبير الشائعة المرتبطة EMT، مثل الزيادة في CREB فسفرته وERK1 / 2 ينظر في كل من MCF7 والخلايا التي يسببها EMT A549. S133 الفسفرة من CREB يحفز الحمض النووي ملزمة، ولقد ثبت أن يتصرف المصب من TGF-β1 التي يسببها EMT 15. وقد تبين أيضا ERK1 / 2 الفسفرة للعمل المصب TGF-β1 التي يسببها EMT 16. كما يمكن توضيح الاختلافات في مسارات الإشارات بين الخلايا أنواع كما رأينا مع الزيادة في GSK-3β الفسفرة في خلايا A549 مقابل p70S6K الفسفرة في MCF7. الفسفرة GSK-3β في 9 سيرين أنه يقلل وظيفة، ولقد ثبت GSK-3β لمنع عامل النسخ المؤيدة للEMT، الحلزون 17. في المقابل، يدفع p70S6K النشاط الحلزون ويرتبط الفسفرة مع تفعيل هذا البروتين 18.
عموما، تحريض واضحة وموثوق بها من EMT، لا سيما في الخلايا هو موضح سابقا عدم الرد فقط لTGF-β، مفيد لفهم بيولوجيا EMT، وتحديد التوقيعات التعبير الشائع لاستخدامها بوصفها علامات النذير، وتطوير وتقييم علاجات جديدة للسرطان والمرض متليفة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه جوليا Hatler ومارتن رامسدن (R & D أنظمة) للمناقشة مفيدة ومراجعة مخطوطة.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
| EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
| Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
| Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
| Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
| Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
| Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
| Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
| Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
| EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
| 96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
| Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
| Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| 95% Ethanol | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
| DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
| Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
| 12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
| Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
| TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
| PVDF Membrane | For western blotting | ||
| 4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
| ECL substrate | For western blotting | ||
| 15 ml conical tubes | |||
| Plates/flasks, tissue culture treated | |||
| 24-well plates, tissue culture treated | |||
| Pipettes / pipette tips | |||
| Pipet Aid / pipets | |||
| Hemocytometer | |||
| 37 °C Water Bath | |||
| 37 °C/5%CO2 Incubator | |||
| Centrifuge | |||
| Inverted light microscope | |||
| Fluorescence microscope |
Referências
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Thiery, J. P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).
- Heuberger, J., Birchmeier, W. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).
- Onder, T. T. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Pesquisa do Câncer. 68, 3645-3654 (2008).
- Tian, X. E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).
- Scheel, C. Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell. 145, 926-940 (2011).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Research. 19, 156-172 (2009).
- Kasai, H. TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition. EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).
- Miettinen, P. J., et al. TGF-β induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).
- Pelton, R. W., et al. Differential expression of genes encoding TGFs β1, β2, and β3 during murine palate formation. Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).
- Taube, J. H. Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes. PNAS. 107, 15449-15454 (2010).
- Roussos, E. T., et al. AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment. Pesquisa do Câncer. 70, 7360-7364 (2010).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).
- Brown, K. A. Induction by transforming growth factor-β1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro. Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).
- De Falco, V., et al. CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells. Pesquisa do Câncer. 72, 1449-1458 (2012).
- Xie, L. Activation of the Erk pathway is required for TGF-β1-induced EMT in vitro. Neoplasia. 6, 603-610 (2004).
- Bachelder, R. E., et al. Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).
- Pon, Y. L. p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells. Pesquisa do Câncer. 68, 6524-6532 (2008).
- Wegner, G. J., et al. Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays. J. Vis. Exp. , (2012).
