Tregs имеют решающее значение для поддержания иммунной толерантности и, чтобы ослабить превышение иммунных реакций. Tregs подавлять наблюдателем активацию Т-клеток. Следовательно, абляция Tregs приводит к фатальным аутоиммунные и самоуничтожение обусловлен активированных Т-клеток ^1. Tregs развиваться в тимусе при отрицательной селекции клеток CD4 одним положительным предшественников, но они также могут дифференцироваться в периферии от наивных CD4 Т-клеток при низких дозах антигена стимуляции с субоптимальной костимуляцию ^1,2. Тимуса Tregs кажется подавить ткани аутоиммунные против аутоантигенов, в то время как периферийная Tregs были вовлечены в обеспечении толерантности в кишки или легкого. Эти индуцированные Tregs мощно предотвратить активацию Т-клеток после признания чужеродных антигенов в слизистой оболочке, в том числе экологических антигенов из пищи и воздуха, синантропных бактерий и аллергенов ^3,4. Кроме того, Tregs имеют решающее значение для создания материнской толерантности к плода пептиды ⁵ и предварительновентиляционные трансплантат против хозяина ^6. В то же время, Tregs также посредником нежелательных эффектов путем ослабления иммунного надзора опухолевых клеток ^7,8. Отличительной особенностью Tregs является выражением подмножество указанием Foxp3-фактор транскрипции, вилка-головной домен-содержащий транскрипционный фактор, который является необходимым и достаточным для придания Treg функции ^9,10. Некоторые сигнальных путей, которые могут индуцировать Foxp3 экспрессии, хорошо известны. Однако молекулярные процессы, контроля, регулирования, или модулировать Treg дифференцировка на Т-клеточный рецептор запуска менее понятны.

Tregs может быть очень эффективно индуцированных в пробирке посредством стимуляции наивным Т-клеток CD4 анти-CD3 и анти-CD28 антитела в присутствии TGF-и ИЛ-2 ^11. Поскольку новые Tregs функциональны в естественных условиях, манипулирование молекулами, которые способствуют Treg дифференциации несет огромный потенциал для будущего therapiы, например, при лечении астмы, болезни Крона, и трансплантации ^11,12. С другой стороны, терапевтическое модуляции молекул блокировать Treg дифференциации может принести пользу в будущем подходы комбинированного лечения онкологических больных.

В анализах пробирке дифференциации играют важную роль для описания молекулярных изменений, которые связаны с Т дифференциации подмножество клетки. На данный момент экспериментальные попытки поиска или экран для генных продуктов, которые контролируют дифференцировки Т-клеток препятствует тот факт, что наиболее распространенными методами эктопической экспрессии гена неудачу в наивных Т-клеток. Например, электропорации и ретровирусной трансдукции эффективны только в активированных Т-клеток. В отличие от первоначальных ожиданий, лентивирусов трансдукции, которое обычно эффективны в покоящихся клеток, требует предварительной активации наивных Т-клеток цитокинами ^13. Кроме того, передача кДНК или мРНК во время электропорациивключает деполяризацию мембраны плазмы, которая сама дает особенности активации Т-клеток и может даже мобилизации Са ^{2 +} сигналов и активировать NFAT белков (неопубликованные наблюдения и реф. ^14). Аналогично, для ретровирусов трансдукции, наивные Т-клетки должны быть активированы в течение 18 – 40 часов. В течение этого времени распада ядерной мембраны в процессе клеточного деления происходит и позволяет последующей интеграции геномной ретровирусный вектор ^15. Эти методы являются, следовательно, не в состоянии решать начале молекулярный регулирование начальной Т встречи клетки с антигеном, который является решающей фазе помощник дифференцировки Т-клеток.

Аденовирусной трансдукции, как известно, придают переходных эктопической экспрессии гена в ряде типов клеток человека, которые экспрессируют человеческий рецептор аденовируса Коксаки (CAR). Это продолжается без требования для активации клеток или клеточного цикла. Поверхностную экспрессию CAR необходимо эффективное присоединение вируса и интернализации и трансгенной экспрессии усеченной версии CARΔ1 под Т-клеток промотора было установлено, оказывают мышь тимоцитов и Т-клетки, восприимчивыми к аденовирусной инфекции ^16. Важно отметить, что трансгенов не изменяет тимоцитов развития или в пробирке дифференцировки наивных CD4 Т-клеток в различные подмножества (данные не приводятся; ссылка ^17.). Аденовирус трансдукции Т-клеток был ранее использован для сверхэкспрессию ^17,18 и нокдауна подходы ^19,20. Трансгенных клеток T может быть очищен из коммерчески доступных DO11.10 ТГ; CARΔ1 ТГ (Taconic, Inc и ссылка ^17.). Важно отметить, что аденовирусной трансдукции позволяет с высокой экспрессией гена интереса к наивным Т-клеткам, не вызывая очевидных признаков активации. Т-клетки остаются наивными (CD44 ^{низкий,} CD62L ^{высокий)} и отдыха (CD25 ^-, CD69 ^-) после Infectiна и может быть активирована и дифференцировались в Treg похожа на неинфицированных клеток.

Получение рекомбинантных аденовирусов может быть достигнута после трансфекции клетки HEK293A с аденовирусной плазмиды (фиг. 1). Эти плазмиды обычно содержат человеческий тип 5 геном аденовируса с E1 и E3 генов удален оказывать рекомбинантных аденовирусов репликации некомпетентные ^21. HEK293A клетки дополняют репликации дефицита, как они были увековечены через стабильной интеграции стриженого аденовирус ^22. С аденовирусных векторов большие (~ 40 Kb) и, следовательно, не очень хорошо подходит для традиционных ферментов рестрикции-опосредованной клонирование, мы использовали шлюза системы. Интерес ген первоначально клонировали в меньший входной вектор, из которого можно легко переносить в аденовирусный вектор назначения через лямбда реакции рекомбинации (LR) ^23. Мы построили pCAGAdDu векторпутем объединения CAG промотор (курица промотор актина и энхансер CMV) счет экспрессирующей кассеты, содержащей LR сайтов, фланкирующих прокариотических выбор CCDB маркер ^24. Эта кассета экспрессии слитого с внутреннего входа рибосом (IRES) элемент, который позволяет совместной экспрессии эукариотических инфекции маркер усиленный зеленый флуоресцентный белок (УЗФБ), которые слиты с последовательностью, содержащей бычьего гормона роста поли (А)-сигнала. Мы выбрали CAG цис-регуляторных последовательностей, так как прототип промотор CMV было обнаружено, что чрезвычайно-зависимой активации и, следовательно, неблагоприятных для экспрессии генов в наивным Т-клеток.

Здесь мы приводим протокол для эффективной дифференциации в пробирке Treg и способу для трансдукции наивных CD4 Т-клеток без активации (фиг. 2). Метод позволяет эктопическая экспрессия гена или сбить предыдущего CD4 Т-клеток в наивной государства. Это позволяет тестирования эффекта overexpresseD интересующего гена в раннем сигнальных событий при первоначальной стимуляции TCR до T приверженность подмножество клетки. Наши эксперименты проверки также обеспечивают основу для создания аналогичных приложений аденовирус в дифференцировке клетки других подмножеств T, таких как Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, или TFH клеток.