ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（<em>ミツバチ</em>）
Summary
このプロトコルでは、我々は同時に、ミツバチの二つの遺伝子（二重遺伝子ノックダウン）を抑制の2つの戦略について説明します。その後私たちはミツバチ味覚知覚に二重遺伝子ノックダウンの効果を研究するために口先拡張応答（PER）アッセイを使用する方法を提示します。
Abstract
このビデオでは、二本鎖RNA（dsRNA）注射を用いたミツバチで同時に二つの遺伝子をダウンレギュレートするRNA干渉（RNAi）の新規技術を示しています。また、味覚の知覚を測定するための口先拡張応答（PER）アッセイのプロトコルを提示します。
RNAiによる遺伝子ノックダウンは、標的遺伝子の発現をダウンレギュレーション有効な技術である。この技術は、通常、単一の遺伝子操作に用いられるが、それは相互作用と遺伝子との接合効果を検出するための限界を有している。このビデオの最初の部分で、我々は、同時に2つの遺伝子を（二重遺伝子ノックダウンと呼ばれる）をノックダウンするための2つの戦略を提示する。我々は両方の戦略が効果的に規制のフィードバックループにある2つの遺伝子、ビテロゲニン（VG）とピラクル（USP）を抑制することができますを示しています。この二重の遺伝子ノックダウンのアプローチは、遺伝子間の相互関係を分析するために使用することができ、容易に適用することができ異なる昆虫種。
このビデオの第二部は、二重遺伝子ノックダウンの治療後のミツバチで口先拡張応答（PER）アッセイのデモンストレーションです。 PERアッセイは、ミツバチ、ミツバチの行動の成熟がどれほど速いの鍵な予測因子であるの味覚の知覚を測定するための標準的なテストです。巣ミツバチの大味覚認識は、多くの場合、花粉の特化を餌と餌の発症に早い年齢に関連付けられて増加した行動の発展を示している。また、PERアッセイはミツバチに飽食か飢餓の代謝状態を識別するために適用することができます。最後に、1アッセイあたりミツバチも広くミツバチの学習と記憶研究のために使用されているエアコンに異なる匂い刺激をペアリングと組み合わせる。
Introduction
RNA干渉（RNAi）は、真核生物の多種多様に発生するRNAベースの転写後遺伝子サイレンシングである。 RNAiのプロセスは、内因性又は外因性の二本鎖RNA（dsRNA）前駆物質によって引き起こされる。 dsRNAは、結合して小さな断片（20〜25塩基対）へのdsRNAを切断するリボヌクレアーゼタンパク質ダイサーを活性化する。 dsRNAのガイドの、小さな断片アルゴノートタンパク質による補完的なmRNAの認識と切断、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）1の触媒成分。哺乳類では、30ヌクレオチドより長いdsRNAはは、RNA転写産物2の非特異的な劣化につながる抗ウイルス応答（インターフェロン応答、IFN）を活性化する。しかし、長いdsRNAは、このIFN 3の不足しているため、昆虫に有効かつ特異的であることが証明されている。
長いdsRNAは、異なる昆虫種の標的遺伝子の下方制御に使用されてきた。ミツバチは、パイオンの一つです発達や行動の多くの重要な遺伝子の機能がdsRNAは4,5を使用することによって明らかにされているEER昆虫生物。いくつかのdsRNAの発送方法はミツバチで行われています：dsRNAをインジェクションはミツバチの胚4と成体ミツバチ7,8の遺伝子ノックダウンのための効果的なアプローチであるのに対し、dsRNAを送り、効率的に、ミツバチの幼虫6に標的遺伝子の発現を下方制御する。
昆虫へのdsRNAを適用することにより、展示遺伝子ノックダウン効果は一過性とローカライズされています。研究では、腹部のdsRNA注射胸部のdsRNA注射の両方を効果的に昆虫9,10の腹部脂肪体細胞において標的遺伝子の発現を抑制することが示されている。 dsRNAは、細胞が10を浴びている血リンパからのdsRNAを取ることができている腹部や胸部の空洞や脂肪体細胞内に注入される。しかし、そのような卵巣や脳などの他の臓器、の遺伝子のいずれかが対象とすることはできません腹部や胸部注射。ミツバチの脳内の遺伝子を標的とするためには、dsRNAの脳の注入は効果的局所脳領域11内の標的遺伝子の発現に影響を及ぼす、行われている。ここで、我々は唯一の、より一般的に成人のミツバチで使用されている腹部のdsRNA注入を文書化します。
RNAiは、主に単一遺伝子を標的とするために使用されており、遺伝子の機能を明らかにするための強力なツールとなっている。しかし、任意の遺伝子は他から絶縁されていません、それは複雑な制御ネットワークである。生物学的プロセスを理解するための鍵は、遺伝子が複数の遺伝子の同時操作ではなく、単一の遺伝子ノックダウンを必要とする、どのように相互作用するかを詳細に分析することである。哺乳動物細胞株において、科学者は、送達システム12またはマルチマイクロRNA（miRNAの）ヘアピンのデザイン13を用いて同時に阻害する二、三の遺伝子に成功した。しかし昆虫で、複数の遺伝子ノックダウンはまだ未検証です。ここでは、プレゼンテーション二重の遺伝子ノックダウンを達成することができますトンの異なる注入戦略。卵黄タンパク質前駆体をコードしてビテロゲニン（VG）、及び幼若ホルモン（JH）のため推定受容体をコードし、ミツバチにJH 14への応答を仲介する転写因子として働くことができるピラクル（USP）：我々は2つの遺伝子をターゲットにしています。 VGとJHは、フィードバックループ15でお互いを調節し、ミツバチの行動規制9に関与している。二重の遺伝子ノックダウンを使用して、我乱すVgを両方とJH経路、そして、彼らが共同でミツバチの行動と生理機能とどのようにVG、USPとJHは9対話にどのように影響するかを発見する。
味覚認識はミツバチ社会的行動のための16の行動予測因子である。高い味覚認知と行動の発達、巣のミツバチ行動成熟速く、通常人生の早い段階で飼料の観点と花粉16,17を収集することを好む。ものの規制M味覚認識を根底echanismsはまだ不明で、研究は味覚知覚は内部エネルギー代謝9、ホルモン分泌18,19及び生物遺伝アミンにリンクされていることが示されている20の経路。 VgはとJHの両方が変調味覚認知7,21重要なホルモンのレギュレータです。研究室では、ミツバチで味覚知覚の変化が異なるショ糖溶液に口先拡張応答（PER）をテストすることによって評価することができます。各蜂、0.1、0.3、1、3、10、30％スクロースの上昇濃度系列に続いて、水の液滴と彼女のアンテナの両方に触れることによってテストされる。水またはスクロースの液滴は、各アンテナに触れたときのハチが完全に彼女の口吻を拡張する場合は正の応答が注目される。ソリューションに対する肯定応答の数に基づいて、各個体の味覚知覚レベルが16を決定することができる。しかし、PERの適用はグラム測定に限定されるものではないustatory認識。 PERはまた、このような飽食対飢餓としてミツバチの代謝状態をテストするための有効な方法である。ショ糖へのより大きな応答とミツバチは、一般的にハングリー（王とAmdam、未発表データ）である。また、PERパラダイムはミツバチに連想学習と記憶にも使用することができます。このケースではミツバチは臭気とショ糖水の存在を関連付けるために訓練されます。ミツバチが関連を学ぶとき、臭気の唯一の存在は、スクロース22,23とそれらを報いることなく、正口先応答を呼び起こすことができます。このビデオでは、我々は以前の研究9でVGとUSPダブルノックダウンで接続された味覚の知覚を評価するために、PERを実行する方法を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々の研究は、同時に成虫に二つの遺伝子をノックダウンするための最初の取り組みです。我々の結果は、dsRNAを注射（単回注射と二日間の注射）の2つの戦略は、二重遺伝子抑制に有効であることを示している、とVGとUSPの同時遺伝子サイレン蜂8,9に6日間dsRNAを注射した後にテストすることができます。しかし、遺伝子ノックダウンの効果は、細胞や臓器によって標的遺…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、実験を支援するエリンFennernに感謝したいと思います。この作品は、ノルウェーの研究評議会（180504、185306及び191699）、ピュー慈善トラスト、および国立老化研究所（NIA P01 AG22500）によって賄われていた。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
Referências
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