RNA interferentie (RNAi) is RNA gebaseerde post-transcriptional gene silencing, die optreedt in een grote verscheidenheid van eukaryote organismen. Het proces van RNAi wordt veroorzaakt door endogene of exogene dubbelstrengs RNA (dsRNA) precursors. De dsRNA activeert de ribonuclease eiwit Dicer die bindt en splitst de dsRNA om kleine fragmenten (20-25 bp). Dan is de kleine fragmenten van de dsRNA gids een erkenning en splitsing van complementaire mRNA door argonaute eiwitten, een katalytisch bestanddeel van RNA-induced silencing complex (RISC) ^1. In zoogdieren, dsRNA langer dan 30 nt, activeert een antivirale respons (interferon respons, IFN) wat leidt tot niet-specifieke afbraak van RNA transcripten ^2. Echter, lange dsRNA bewezen effectief en specifiek in insecten aangezien er een tekort aan dit IFN ^3.

Lange dsRNA's zijn gebruikt voor downregulatie van doelgenen in verschillende insectensoorten. Honingbijen zijn een van de pioneer insect organismen waarin functies van veel belangrijke genen in de ontwikkeling en het gedrag zijn geopenbaard door dsRNA ^4,5. Verschillende dsRNA levering methoden zijn uitgevoerd in honingbijen: dsRNA voeden efficiënt downregulates doelwit genexpressie in honingbij larven ^6, terwijl dsRNA injectie is een effectieve aanpak voor gen knock-down in honingbij embryo's ⁴ en volwassen bijen ^7,8.

Gen knock-down effecten vertoond door het toepassen van dsRNA om insecten zijn van voorbijgaande aard en gelokaliseerd. Studies hebben aangetoond dat zowel abdominale dsRNA injecties en thoracale dsRNA injectie effectief te onderdrukken doelwitgenexpressie in buikvet lichaamscellen insecten ^9,10. DsRNA wordt geïnjecteerd in de buik en borstkas holten en vet lichaamscellen in staat zijn tot het nemen van de dsRNA uit de hemolymfe waar de cellen worden gebaad ^10. Echter, kunnen genen in andere organen zoals eierstokken en de hersenen, niet gericht door eenabdominale of thoracale injecties. Om de genen in honingbij hersenen richten, heeft hersenen injectie van dsRNA ook uitgevoerd, die effectief beïnvloedt doelwit genexpressie in lokale hersengebieden ^11. Hier, we documenteren alleen abdominale dsRNA injectie die wordt vaker gebruikt bij volwassen bijen.

RNAi is voornamelijk gebruikt voor richten op een enkel gen en is een krachtig middel om de genfunctie te onthullen. Echter een gen niet geïsoleerd van anderen, het is in complexe regulerende netwerken. Een sleutel tot een biologisch proces te begrijpen is te ontleden hoe de genen met elkaar, die gelijktijdig manipulaties van meerdere genen in plaats van een enkel gen knockdown vereist. In zoogdiercellijnen, hebben wetenschappers in gelijktijdig remmen van twee of drie genen opgevolgd door gebruik afgiftesystemen ¹² of multi-microRNA (miRNA) haarspeld designs ^13. Maar bij insecten, meerdere genen knockdowns zijn nog niet getest. Hier hebben we present verschillende injectie strategieën die een dubbele gen knockdown kan bereiken. We richten twee genen: vitellogenin (vg) die een dooier eiwit precursor codeert en Ultraspiracle (USP) dat een vermeende receptor voor juveniel hormoon (JH) codeert en kan dienen als een transcriptiefactor bemiddelende reacties op JH ¹⁴ in honingbijen. Vg en JH reguleren elkaar in een feedback loop ¹⁵ en zijn betrokken bij honingbij gedragregulatie ^9. Met behulp van de dubbele-gen knock-down, we verstoren zowel Vg en JH paden en ontdekken hoe zij gezamenlijk invloed honingbij gedrag en fysiologie, en hoe vg, usp en JH interageren ^9.

Smaak perceptie is een gedrags voorspeller voor honingbij sociaal gedrag ^16. In termen van gedragsontwikkeling, nest bijen met hoge smaak perceptie gedragsgestoorde volwassen snel, en meestal voedergewassen vroeg in het leven en liever pollen ^16,17 verzamelen. Hoewel de regelgeving mechanisms onderliggende smaak perceptie nog onduidelijk, studies hebben aangetoond dat smaak perceptie verbonden inwendige energie metabolisme ^9, hormonale secretie ^18,19 en biogene amine paden ^20. Zowel Vg en JH zijn belangrijke hormonale regelaars moduleren smaak perceptie ^7,21. In het laboratorium kan een variatie van smaak perceptie bij bijen worden beoordeeld door het testen van de proboscis extensie respons (PER) verschillende sacharoseoplossingen. Elke bij wordt getest door het aanraken haar beide antennes met een druppel water, gevolgd door een oplopende concentratie reeks van 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% sucrose. Een positief antwoord wordt genoteerd als een honingbij volledig breidt haar slurf als een druppel water of sucrose wordt geraakt aan elke antenne. Gebaseerd op het aantal positieve reacties op de oplossingen kan de smaak perceptie van elke afzonderlijke bepaald ^16. Echter, de toepassing van de PER niet beperkt tot het meten gustatory perceptie. De PER is ook een effectieve methode om de metabole toestand van de bijen, zoals verzadiging vs honger te testen. De bijen met een grotere reacties op sucrose zijn hongeriger in het algemeen (Wang en Amdam, ongepubliceerde gegevens). Voorts kan de PER paradigma worden gebruikt associatief leren en geheugen bij bijen. In dit geval zal de bijen worden opgeleid om de aanwezigheid van sucrose water associëren met een geur. Wanneer de bijen te leren van de vereniging, kan alleen de aanwezigheid van de geur een positieve slurf reactie op te roepen zonder hen te belonen met de sucrose ^22,23. In deze video laten we zien hoe PER naar smaak perceptie die is verbonden met vg pt usp dubbele knock-down in een eerdere studie ⁹ evaluatie uit te voeren.